Autoren:	Hildebrand, Andre
Titel:	Funktionelle und strukturelle Charakterisierung des Ovastacins in vivo und in vitro
Online-Publikationsdatum:	11-Sep-2013
Erscheinungsdatum:	2013
Sprache des Dokuments:	Deutsch
Zusammenfassung/Abstract:	Die Metalloprotease Ovastacin, ein Vertreter der Astacin-Familie, wurde erstmals 2004 beschrieben. Im Ovar von Säugetieren ist Ovastacin-mRNA im Zeitfenster vom Stadium der Sekundärfollikel bis kurz nach der Befruchtung der Eizelle zu finden. Der Expressionsort und -zeitpunkt sowie die Sequenzähnlichkeit von über 60% mit sogenannten â Schlüpfenzymenâ (engl. hatching enzymes), die man in den Eizellen und Zygoten niederer Wirbeltiere und Wirbelloser gefunden hatte, ließen die Vermutung aufkommen, es könnte sich hier um das Säugerhomolog dieser Proteasen handeln. Generell lösen hatching Enzyme die derben embryonalen Hüllstrukturen (bei Säugern die Zona pellucida, ZP) beim Schlüpfvorgang auf. Die essentielle Bedeutung des Ovastacins für die Befruchtung wird durch die um ca. 30% reduzierte Fruchtbarkeit von Ovastacin defizienten Mäusen belegt. Hochinteressant war in diesem Zusammenhang die Entdeckung des Ovastacins in den Cortikalgranula der Oocyten sowie seine Fähigkeit, das Zona pellucida Protein 2 zu schneiden. Die dadurch bewirkte Verhärtung der Zona pellucida verhindert das Eindringen weiterer Spermien, das heißt sie baut eine Barriere gegen Polyspermie auf. Ziel dieser Arbeit war es, Belege für die physiologische Funktion des Ovastacins zu finden. Vor allem galt es, potentielle Aktivatoren zu identifizieren, da das Enzym wie alle Astacine als inaktive Vorstufe gebildet wird, die proteolytisch aktiviert werden muss. Zu diesem Zweck exprimierte ich rekombinantes Pro-Ovastacin in Insektenzellen. Aktivierungsstudien in vitro zeigten, dass ein saures Milieu zu einer Aktivierung führt, ohne die Abspaltung des Propeptids zu bewirken. Sequenzalignments und ein homologes Strukturmodell des Ovastacins wiesen auf Trypsin- oder Elastase-ähnliche Serinproteasen als potentielle Aktivierungsenzyme hin. Tatsächlich konnte mit diesen beiden Proteasetypen zum ersten Mal aktives Ovastacin aus Pro-Ovastacin erzeugt werden. Trypsin kommt als physiologischer Aktivator allerdings nicht in Betracht, da es bisher in keinem der Gewebe nachgewiesen werden konnte, in dem Ovastacin exprimiert wird. Die neutrophile Elastase dagegen konnte in der Leber, im Herz sowie im Blutplasma nachgewiesen werden. Mit Hilfe spezifischer Antikörper konnte das Herz als Expressionsort für Ovastacin bestätigt werden. Somit wäre Elastase ein potentieller physiologischer Aktivator von Ovastacin. Die Identifikation des Ovastacins in Geweben wie Leber, Herz, Nabelschnur und im Blutplasma weist auf eine Rolle der Protease in proteolytischen Netzwerken außerhalb der Spermien-Ei-Interaktion hin. Die Bedeutung der biologischen Kontrolle des Ovastacins bei der Befruchtung der Säugereizelle wird durch die Beobachtung untermauert, dass das Leberprotein Fetuin B als physiologischer Ovastacininhibitor fungiert und dadurch eine vorzeitige Verhärtung der Zona pellucida verhindert, die andernfalls die Penetration von Spermien prinzipiell verhindern würde. The ovastacin metalloprotease, a member of the astacin family, was first described in 2004. In the ovary of mammals ovastacin mRNA is present in the period from the stage of secondary follicle cells until shortly after fertilization of the egg. Both place and time of expression as well as the sequence similarity of more than 60% with the so-called â hatching enzymesâ that had been found in oocytes and zygotes of lower vertebrates and invertebrates, gave rise to the presumption that ovastacin might be the mammalian homologue of these proteases. Generally, hatching enzymes dissolve the crude embryonic shell structures (in mammals, the zona pellucida, ZP). The reduced fertility by about 30% of ovastacin deficient mice is evidence for the essential meaning of ovastacin for fertilization. Of particular interesting in this context was the discovery of ovastacin in cortical granules of oocytes and its ability to cleave the zona pellucida protein 2 resulting in the hardening of the zona pellucida. Zona pellucida hardening prevents further sperm penetration because it builds a barrier to polyspermy. The aim of this work was to find evidence of the physiological function of ovastacin. Mainly to identify potential activators, since the enzyme like all astacins is formed as an inactive precursor that must be proteolytically activated. To this end, I expressed recombinant pro-ovastacin in insect cells. In vitro studies showed that an acidic environment leads to activation without causing the cleavage of the propeptide. Sequence alignments and a homologous structural model of ovastacin pointed to trypsin or elastase-like serine proteases as potential activating enzymes. In fact, due to these two types of proteases, active ovastacin was produced from pro-ovastacin for the first time. Trypsin is not a physiological activator, because it was not detected in any of the tissues, in which ovastacin expression was already shown before. On the other hand, the neutrophil elastase was detected in the liver, the heart and the blood plasma. Using specific antibodies, the heart could be confirmed as an expression site for ovastacin. Thus elastase would be a potential physiological activator of ovastacin. The identification of ovastacin in tissues such as liver, heart, umbilical cord and the blood plasma indicates a role of this protease in the proteolytic networks outside of the sperm-egg interaction. The importance of biological control of ovastacin in fertilization of the oocyte is underpinned by the observation that the liver protein fetuin B acts as a physiological inhibitor of ovastacin. It thereby prevents premature hardening of the zona pellucida that otherwise would prevent the penetration of sperm in principle.
DDC-Sachgruppe:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Veröffentlichende Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Organisationseinheit:	FB 10 Biologie
Veröffentlichungsort:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1741
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-35159
Version:	Original work
Publikationstyp:	Dissertation
Nutzungsrechte:	Urheberrechtsschutz
Informationen zu den Nutzungsrechten:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Umfang:	140 S.
Enthalten in den Sammlungen:	JGU-Publikationen