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Authors: Schacht, Teresa
Title: Neuronal calcium-binding protein 2 (NECAB2): Charakterisierung eines striatalen Ca 2+ -bindenden Proteins
Online publication date: 17-Oct-2017
Language: german
Abstract: NECAB2 (Neuronal Calcium-Binding protein 2) gehört zur NECAB Familie (NECAB1-3) und ist ein neuronales Protein mit 389 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von ca. 43 kDa. Im Hirn wird es vorwiegend im Striatum und in der CA1 und CA2 Region des Hippocampus exprimiert. NECAB2 besteht aus zwei EF-Hand Domänen, einer NECAB homology region (NHR) Domäne und einer antibiotischen Monooxygenasedomäne (ABM). Strukturelle und funktionelle Analysen eines bakteriellen ABM Homologs aus Streptomyces ließen vermuten, dass das Protein als Dimer vorliegt und möglicherweise an der Detoxifikation reaktiver Sauerstoffspezies beteiligt ist. Des Weiteren interagiert NECAB2 mit dem metabotropen Glutamat Rezeptor 5 (mGluR5) und dem Adenosin Rezeptor 2A (A2AR) und erhöht deren Rezeptoraktivitäten. Ziel dieser Arbeit war es NECAB2 näher zu charakterisieren und Hinweise zur Funktion zu bekommen. Mithilfe von immunhistochemischen Methoden konnte die Expression von NECAB2 im Striatum und in der CA2 Region, jedoch nicht in der CA1 Region des Hippocampus bestätigt werden. Ferner wurde erstmals eine starke Expression in den Habenulae gefunden. Des Weiteren konnten Stimulated emission depletion (STED)-mikroskopische Aufnahmen eine vorwiegend präsynaptische Expression von NECAB2 in striatalen Neuronen von E16-E18 Embryos zeigen. Sowohl Experimente mit dem eigens in dieser Arbeit aufgereinigten, rekombinanten NECAB2 Protein und mit Hirnlysaten als auch mikroskopische Experimente mit überexprimierenden NECAB2-Zelllinien zeigten eine Ca2 -abhängige Dimerisierung. Um herauszufinden, welche Domäne zum einen für die Homodimerisierung und zum anderen für die Interaktion mit mGluR5 verantwortlich ist, wurden Mutanten generiert, denen entweder die Coiled-coiled 1 (CC1), die Coiled-coiled 2 (CC2) oder die ABM Domäne fehlt. Eine weitere Mutante besitzt zwei Punktmutationen (E84A-E118A) im aktiven Zentrum der EF-Hand Domäne. Die CC1 Domäne konnte sowohl als Dimerisierungsdomäne als auch als Interaktionsdomäne von mGluR5 identifiziert werden. Des Weiteren wurde der Effekt des NECAB2 KO untersucht. Dabei zeigten Proteinexpressionsanalysen in den NECAB2 KO Mäusen eine tendenzielle, aber nicht signifikante Herunteregulierung von mGluR5 und A2AR. Verhaltensexperimente mit NECAB2 KO Mäusen konnten im Vergleich zu den Kontrollmäusen eine signifikant beeinträchtigte sensorische Reizverarbeitung sowie eine signifikant verminderte Motivation aufweisen. Dieses Ergebnis weist daraufhin, dass NECAB2 einen Einfluss auf das dopaminerge System spielen könnte. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass NECAB2 vorwiegend im Striatum exprimiert wird und striatale Funktionen zeigt. Die Interaktion mit mGluR5 erfolgt mittels der CC1 Domäne von NECAB2. Kommt es zur Aktivierung des mGluR5 und damit zum Calciumeinstrom aus dem ER, dimerisiert NECAB2 Ca2 -abhängig mittels der CC1 Domäne. Beim Fehlen von NECAB2 kommt es zu einer tendenziellen Herunterregulierung von mGluR5 und A2AR und damit zu einer beeinträchtigten sensorischen Reizverarbeitung und zu einer verminderten Motivation. Vor diesem Hintergrund spielt NECAB2 vermutlich eine wichtige Rolle bei der Interaktion des A2AR-mGluR5-Dopamin D2R Komplexes und hat damit sowohl Einfluss auf das dopaminerge System als auch auf den cAMP Spiegel im Striatum.
NECAB2 (Neuronal Calcium-binding protein 2), a member of the NECAB family, is a neuronal protein with 389 amino acids and a molecular weight of 43 kDa. In the brain, it is mainly expressed in the striatum and in the hippocampal CA1 and CA2 area. NECAB2 consists of two EF-hand domains, one NECAB homology region (NHR) and one antibiotic monooxygenase domain (ABM). Structural and functional analyses of a bacterial homolog from Streptomyces indicate that the protein forms a dimer and is likely involved in detoxification of reactive oxygen species. Furthermore, NECAB2 interacts with metabotropic glutamate receptor 5 (mGluR5) and adenosine receptor 2A (A2AR) thereby increasing receptor signaling. The aim of this study was to more precisely characterize the function of NECAB2. Immunhistochemical studies revealed a strong expression of NECAB2 in the striatum and in the hippocampal CA2 area. Previous studies, indicating expression of this protein in the CA1 area, could not be confirmed. Additionally, there was a strong expression of NECAB2 in the habenulae. Stimulated emission depletion (STED) microscope imaging showed a predominantly presynaptic expression in striatal neurons of E16-E18 embryos. Assays with recombinant NECAB2 protein, which was generated as part of this thesis, and with brain lysates showed a Ca2 -dependent dimerization of NECAB2. Confocal microscopy with overexpressed NECAB2 cell lines confirmed these findings. NECAB2 mutants lacking either the coiled-coiled 1 (CC1), the coiled-coiled 2 (CC2), the ABM domain or containing two point mutations (E84A-E118A) in the active site of the EF-hand were generated to identify the domains responsible for homodimerizaton and the interaction with mGluR5. Furthermore, NECAB2 knockout (KO) in mice resulted in moderate, but not significant, downregulation of mGluR5 and A2AR-according to protein expression analyses. In comparison to wild type animals, NECAB2 KO animals showed a significant impairment in sensorimotor gating and reduced motivation. These results lead to the hypothesis that NECAB2 might influence the dopaminergic system. In conclusion, these results demonstrate that NECAB2 is mainly expressed in the striatum, that the protein modulates striatal functions and that the CC1 domain of NECAB2 mediates the interaction with mGluR5. Activation of mGluR5 leads to calcium release from the ER and Ca2 -dependent dimerization of NECAB2 via its CC1 domain. In NECAB2 KO mice a downregulation of mGluR5 and A2AR occur. Furthermore, the sensorimotor gating is impaired in these mice and their motivation is reduced. It is probable that NECAB2 plays an important role in the interaction of the A2AR-mGluR5-Dopamine D2R complex. For this reason NECAB2 has putative influence on the dopaminergic system and on cAMP levels in the striatum.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 04 Medizin
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-1728
URN: urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000015805
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: VII, 135 Blätter
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