Analyse zellfreier Tumor-DNA im Blut von Tumorpatienten in Situationen physischer Belastung mittels einer neuen, hochsensitiven quantitativen nested real-time-PCR-Anwendung
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Krebs ist in den Industrienationen eines der höchsten Gesundheitsrisiken, mit steigender Tendenz. Auch steigende Kenntnisse zu gesunder Ernährung, sportlicher Aktivität, Risikofaktoren und einem allgemein gesunden Lebensstil sind bisher nicht in der Lage gewesen, die Inzidenzrate der Tumorneuerkrankungen signifikant zu senken. Durch die unterschiedlichen Krankheitsverläufe und die hohe Heterogenität von Tumoren wird zudem immer deutlicher, dass es kein universelles Allheilmittel geben wird. Somit kommt der Krebsdiagnostik die entscheidende Rolle zu, das benötigte Wissen für optimale, möglichst individuelle Therapien für Patienten zu generieren. In den letzten Jahren und Jahrzehnten wurden viele molekularbiologische Methoden entwickelt, um genaue Kenntnisse über Tumoranatomie, -physiologie und insbesondere Tumorgenetik zu gewinnen, die ein Schlüssel zur Therapie sein kann.
Verschiedenste Ansätze, wie die Quantifizierung zirkulierender Tumorzellen (CTCs), zellfreier DNA (cfDNA) und zellfreier Tumor-DNA (ctDNA) zeigten ihren diagnostischen, prognostischen und prädiktiven Wert in zahlreichen Studien. Gerade die ctDNA scheint hierbei einen großen Wert zu besitzen. Sie kann auf nicht- bis gering-invasivem Wege gewonnen werden, entweder durch Stuhl- oder Urinproben, oder aber durch Blutserum oder -plasma. Mittels DNA-Sequenzierung, quantitativer real-time- oder digitaler PCR oder Verbindungen dieser Ansätze ist es mittlerweile möglich, kleinste Konzentrationen an ctDNA anhand von einzelnen Mutationen, Methylierungsmustern Strukturanomalien oder zu detektieren und zu quantifizieren.
In der vorliegenden Arbeit wurde im ersten Schritt eine hochsensitive und -spezifische mutationsspezifische nested-qPCR Methode mit WT-Blocker entwickelt, genannt PNB-qPCR, die ctDNA anhand von KRAS-Punktmutationen erkennt. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung auch einstelliger Konzentrationen an ctDNA-Fragmenten in einem tausendfachen WT-DNA-Überschuss. Diese Methode ist kostengünstig, mittels Standardapparaturen durchführbar und im Einsatzvolumen sehr flexibel, so dass sehr geringe Templatevolumina eingesetzt werden können, wenn das Probenvolumen eingeschränkt ist, andererseits aber auch sehr große Volumina analysiert werden können, wenn die ctDNA-Konzentration sehr niedrig ist.
Diese Analysemethode wurde in zwei Studien an Tumorpatienten erfolgreich eingesetzt. In der ersten Studie wurden Tumorpatienten und Kontrollprobanden auf einem Fahrradergometer ausbelastet und es wurden vor, direkt nach und 90 Minuten nach Ende der Belastung Blutproben entnommen. In diesen wurden cfDNA- und potentiell ctDNA-Konzentrationen sowie DNase-1-Aktivitätsreduktion und Blutparameter bestimmt. Es zeigte sich, dass die ctDNA, ebenso wie die cfDNA, während der Belastung ansteigt und in der Erholungsphase wieder absinkt. Außerdem wies die Tumorgruppe eine deutlich reduzierte Erholungskinetik bezüglich der cfDNA nach der Belastung auf.
In der zweiten Studie wurden Tumorpatienten und Kontrollpatienten vor, während und in den Tagen nach einer Tumor- bzw. Darmgeweberesektion Blutproben entnommen und auf cfDNA und ctDNA sowie DNase-AR hin analysiert. Während die cfDNA über den OP-Verlauf hin anstieg, und dies besonders stark bei Patienten mit nachweisbaren KRAS-Mutationen im Plasma, zeigte die ctDNA einen spezifischeren Verlauf. Sie fiel während des OP-Verlaufs ab, stieg nur direkt nach der Resektion kurzzeitig an und stieg dann wieder in den Tagen nach der Operation langsamer wieder an. Diese Entwicklung ließ sich nicht anhand anderer Parameter erklären und wurde vermutlich durch spezifische Signale ausgelöst. In beiden Studien zeigte die DNase-AR eine der cfDNA gegenläufige Entwicklung bei deutlichen Veränderungen, korrelierte mit dieser aber nicht im Ruhezustand.
In beiden Studien konnte die PNB-qPCR erfolgreich minimale ctDNA-Konzentrationen quantifizieren und wichtige Erkenntnisse und Anhaltspunkte für weitere Studien generieren, die die Herkunft der ctDNA sowie genaue Mechanismen der Freisetzung klären müssen.