Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-1723
Authors: Ehlert, Tobias
Title: Analyse zellfreier Tumor-DNA im Blut von Tumorpatienten in Situationen physischer Belastung mittels einer neuen, hochsensitiven quantitativen nested real-time-PCR-Anwendung
Online publication date: 2-Oct-2017
Language: german
Abstract: Krebs ist in den Industrienationen eines der höchsten Gesundheitsrisiken, mit steigender Tendenz. Auch steigende Kenntnisse zu gesunder Ernährung, sportlicher Aktivität, Risikofaktoren und einem allgemein gesunden Lebensstil sind bisher nicht in der Lage gewesen, die Inzidenzrate der Tumorneuerkrankungen signifikant zu senken. Durch die unterschiedlichen Krankheitsverläufe und die hohe Heterogenität von Tumoren wird zudem immer deutlicher, dass es kein universelles Allheilmittel geben wird. Somit kommt der Krebsdiagnostik die entscheidende Rolle zu, das benötigte Wissen für optimale, möglichst individuelle Therapien für Patienten zu generieren. In den letzten Jahren und Jahrzehnten wurden viele molekularbiologische Methoden entwickelt, um genaue Kenntnisse über Tumoranatomie, -physiologie und insbesondere Tumorgenetik zu gewinnen, die ein Schlüssel zur Therapie sein kann. Verschiedenste Ansätze, wie die Quantifizierung zirkulierender Tumorzellen (CTCs), zellfreier DNA (cfDNA) und zellfreier Tumor-DNA (ctDNA) zeigten ihren diagnostischen, prognostischen und prädiktiven Wert in zahlreichen Studien. Gerade die ctDNA scheint hierbei einen großen Wert zu besitzen. Sie kann auf nicht- bis gering-invasivem Wege gewonnen werden, entweder durch Stuhl- oder Urinproben, oder aber durch Blutserum oder -plasma. Mittels DNA-Sequenzierung, quantitativer real-time- oder digitaler PCR oder Verbindungen dieser Ansätze ist es mittlerweile möglich, kleinste Konzentrationen an ctDNA anhand von einzelnen Mutationen, Methylierungsmustern Strukturanomalien oder zu detektieren und zu quantifizieren. In der vorliegenden Arbeit wurde im ersten Schritt eine hochsensitive und -spezifische mutationsspezifische nested-qPCR Methode mit WT-Blocker entwickelt, genannt PNB-qPCR, die ctDNA anhand von KRAS-Punktmutationen erkennt. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung auch einstelliger Konzentrationen an ctDNA-Fragmenten in einem tausendfachen WT-DNA-Überschuss. Diese Methode ist kostengünstig, mittels Standardapparaturen durchführbar und im Einsatzvolumen sehr flexibel, so dass sehr geringe Templatevolumina eingesetzt werden können, wenn das Probenvolumen eingeschränkt ist, andererseits aber auch sehr große Volumina analysiert werden können, wenn die ctDNA-Konzentration sehr niedrig ist. Diese Analysemethode wurde in zwei Studien an Tumorpatienten erfolgreich eingesetzt. In der ersten Studie wurden Tumorpatienten und Kontrollprobanden auf einem Fahrradergometer ausbelastet und es wurden vor, direkt nach und 90 Minuten nach Ende der Belastung Blutproben entnommen. In diesen wurden cfDNA- und potentiell ctDNA-Konzentrationen sowie DNase-1-Aktivitätsreduktion und Blutparameter bestimmt. Es zeigte sich, dass die ctDNA, ebenso wie die cfDNA, während der Belastung ansteigt und in der Erholungsphase wieder absinkt. Außerdem wies die Tumorgruppe eine deutlich reduzierte Erholungskinetik bezüglich der cfDNA nach der Belastung auf. In der zweiten Studie wurden Tumorpatienten und Kontrollpatienten vor, während und in den Tagen nach einer Tumor- bzw. Darmgeweberesektion Blutproben entnommen und auf cfDNA und ctDNA sowie DNase-AR hin analysiert. Während die cfDNA über den OP-Verlauf hin anstieg, und dies besonders stark bei Patienten mit nachweisbaren KRAS-Mutationen im Plasma, zeigte die ctDNA einen spezifischeren Verlauf. Sie fiel während des OP-Verlaufs ab, stieg nur direkt nach der Resektion kurzzeitig an und stieg dann wieder in den Tagen nach der Operation langsamer wieder an. Diese Entwicklung ließ sich nicht anhand anderer Parameter erklären und wurde vermutlich durch spezifische Signale ausgelöst. In beiden Studien zeigte die DNase-AR eine der cfDNA gegenläufige Entwicklung bei deutlichen Veränderungen, korrelierte mit dieser aber nicht im Ruhezustand. In beiden Studien konnte die PNB-qPCR erfolgreich minimale ctDNA-Konzentrationen quantifizieren und wichtige Erkenntnisse und Anhaltspunkte für weitere Studien generieren, die die Herkunft der ctDNA sowie genaue Mechanismen der Freisetzung klären müssen.
Cancer is an increasing risk factor for health in developed nations. Growing knowledge in the fields of nutrition, sports activity, and a healthy lifestyle in general were not sufficient to significantly reduce overall cancer incidence. The heterogeneous nature of tumors rules out the finding of a universal cure for cancer. Thus, the early diagnosis of a tumor is more and more considered the key for an efficient therapy. Over the last few years, an increasing number of different methods and applications have been generated to gain knowledge of anatomy, physiology, genetics, and epigenetics of tumors to apply individual therapeutical solutions. Circulating tumor cells (CTCs), cell free DNA (cfDNA) and cell free tumor DNA (ctDNA) have become promising targets for early detection and prognosis of cancer development. ctDNA can be obtained with no or minimal invasion into the patient’s system from blood plasma or serum, as well as from urine or stool samples and can be analyzed by quantitative or digital PCR methods or DNA sequencing. By now it is possible to detect and quantify minute amounts of tumor derived DNA by sequence or methylation anomalies from the different bodily fluids. In this work, a highly sensitive and specific approach called PNB-qPCR has been established, that can detect the seven most common point mutations of the KRAS-gene from minute sample sizes of blood plasma by enrichment of tumor mutations in a pre-amplification step. This method was implemented in two studies for the detection and quantification of circulating DNA from plasma of KRAS positive tumor patients. In the first study, tumor patients and matched control patients performed incremental cycling exercise tests until exhaustion. Blood samples were taken prior to, directly after, and 90 minutes after the test. cfDNA, ctDNA, DNase-1-activity, physiological parameters, and blood cell parameters were analyzed. ctDNA was detected in one tumor patient and seemingly increased slightly over exercise and decreased afterwards, but to a lesser extent than total cfDNA. Furthermore, the tumor group showed reduced cfDNA kinetics during recovery. In the second study, blood samples were taken from tumor patients and matched control patients during surgical curative tumor resection and analyzed for cfDNA, ctDNA, and DNase-1-activity. Whereas total cfDNA increased over the surgical process, counterbalanced by DNase-activity reduction (DNase-AR), ctDNA showed independent kinetics. ctDNA concentrations sharply decreased after anesthesia and increased only briefly directly after the resection and then again later in the days following the operation. In both studies, the DNase-AR counterbalanced the cfDNA increases, whereas no correlation between these parameters was detected at rest. PNB-qPCR detected and quantified ctDNA from low plasma volumes in both studies and generated important knowledge about the kinetics of tumor DNA during exceptional physiological circumstances. These findings have to be further examined in follow-up studies that should also concentrate on the origin and release mechanisms of the respective DNA fragments.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 02 Sozialwiss., Medien u. Sport
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-1723
URN: urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000015316
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: xv, 232 Seiten
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