Authors:	Martinez, Alejandra Nacarino
Title:	Analysis of the influence of epitope flanking regions on MHC class I restricted antigen presentation
Online publication date:	18-Dec-2007
Year of first publication:	2007
Language:	english
Abstract:	Peptides presented by MHC class I molecules for CTL recognition are derived mainly from cytosolic proteins. For antigen presentation on the cell surface, epitopes require correct processing by cytosolic and ER proteases, efficient TAP transport and MHC class I binding affinity. The efficiency of epitope generation depends not only on the epitope itself, but also on its flanking regions. In this project, the influence of the C-terminal region of the model epitope SIINFEKL (S8L) from chicken ovalbumin (aa 257-264) on antigen processing has been investigated. S8L is a well characterized epitope presented on the murine MHC class I molecule, H-2Kb. The Flp-In 293Kb cell line was transfected with different constructs each enabling the expression of the S8L sequence with different defined C-terminal flanking regions. The constructs differed at the two first C-terminal positions after the S8L epitope, so called P1’ and P2’. At these sites, all 20 amino acids were exchanged consecutively and tested for their influence on H-2Kb/S8L presentation on the cell surface of the Flp-In 293Kb cells. The detection of this complex was performed by immunostaining and flow cytometry. The prevailing assumption is that proteasomal cleavages are exclusively responsible for the generation of the final C-termini of CTL epitopes. Nevertheless, recent publications showed that TPPII (tripeptidyl peptidase II) is required for the generation of the correct C-terminus of the HLA-A3-restricted HIV epitope Nef(73-82). With this background, the dependence of the S8L generation on proteasomal cleavage of the designed constructs was characterized using proteasomal inhibitors. The results obtained indicate that it is crucial for proteasomal cleavage, which amino acid is flanking the C-terminus of an epitope. Furthermore, partially proteasome independent S8L generation from specific S8L-precursor peptides was observed. Hence, the possibility of other existing endo- or carboxy-peptidases in the cytosol that could be involved in the correct trimming of the C-terminus of antigenic peptides for MHC class I presentation was investigated, performing specific knockdowns and using inhibitors against the target peptidases. In parallel, a purification strategy to identify the novel peptidase was established. The purified peaks showing an endopeptidase activity were further analyzed by mass spectrometry and some potential peptidases (like e.g. Lon) were identified, which have to be further characterized. Es ist allgemein bekannt, daß Peptide, die für CTL-Erkennung auf MHC Klasse I Molekülen präsentiert werden, meist von zytosolischen Proteinen stammen. Solche Peptid-Epitope benötigen für die Antigenpräsentation auf der Zelloberfläche eine gute MHC Klasse I-Bindungsaffinität, einen effizienten TAP-Transport und korrekte Prozessierung durch zytosolische und ER Proteasen. Die Effizienz der Epitopherstellung durch Proteasen hängt nicht nur vom Epitop selber ab, sondern auch von seinen flankierenden Regionen. In diesem Projekt wurde der Einfluß der C-terminalen Region des Modell-Epitops SIINFEKL (S8L) aus dem Hühnereiweiß Ovalbumin (aa 257-264) untersucht, welcher auf dem murinen MHC Klasse I Molekül, H-2Kb präsentiert wird. Die Flp-In 293Kb Zelllinie wurde mit unterschiedlichen S8L exprimierenden Konstrukten transfiziert. Diese Konstrukte unterscheiden sich an den zwei C-terminalen Positionen nach dem S8L Epitop (P1’ und P2’) voneinander, indem jedes Konstrukt an diesen spezifischen Positionen unterschiedliche Aminosäuren aufweist. Somit wurden die 20 existierenden natürlichen Aminosäuren ausgetauscht und deren Einfluß auf die S8L Prozessierung und Präsentation untersucht. Der H-2Kb/S8L Komplex wurde mittels “Immunostaining” und Durchflußzytometrie detektiert. Die vorherrschende Annahme heutzutage ist, daß das Proteasom ausschließlich für die Generierung des korrekten C-Terminus von CTL-Epitopen verantwortlich ist. Jedoch zeigten aktuelle Publikationen, daß TPPII (Tripeptidyl Peptidase II) für die endgültige Generierung des HIV Nef(73- 82) Epitops benötigt wird. Mit diesem Wissen wurde der Einfluß der proteasomalen Aktivität auf die S8L Prozessierung und Präsentation aus den S8L-Konstrukten analysiert. Hierfür wurde das Proteasom mit Inhibitoren wie Lactacystin gehemmt. Es konnte gezeigt werden, daß bestimmte Aminosäuren am C-terminalen Ende des Epitopes vom Proteasom bevorzugt werden und wiederum andere partiell unabhänging von der proteasomalen Aktivität generiert werden. Dies deutet daraufhin, daß es eine neue Endo- oder Carboxy-Peptidase im Zytosol gibt, die das Epitop aus den S8L Vorläufer Konstrukten generieren kann. Aus diesem Grund, wurden in Frage kommende zytosolische Peptidasen durch Inhibitoren oder „Knock-downs“ auf ihren Einfluss auf die S8L Generierung hin untersucht. Parallel hierzu wurde eine Strategie entwickelt um potentielle Peptidasen mittels HPLC Aufreinigung zu identifizieren. Mittels der Massenspektrometrie wurden einige Peptidasen (wie z. B. Lon) identifiziert, die aber weiter charakterisiert werden müssen.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1709
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-14961
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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