Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-1705
Authors: Schlaubitz, Silke
Title: Strategies to identify and further characterize novel and known genes involved in regulation of skeletogenesis
Online publication date: 18-Dec-2007
Year of first publication: 2007
Language: english
Abstract: 372 osteochondrodysplasias and genetically determined dysostoses were reported in 2007 [Superti-Furga and Unger, 2007]. For 215 of these conditions, an association with one or more genes can be stated, while the molecular changes for the remaining syndromes remain illusive to date. Thus, the present dissertation aims at the identification of novel genes involved in processes regarding cartilage/ bone formation, growth, differentiation and homeostasis, which may serve as candidate genes for the above mentioned conditions. Two different approaches were undertaken. Firstly, a high throughput EST sequencing project from a human fetal cartilage library was performed to identify novel genes in early skeletal development (20th week of gestation until 2nd year of life) that could be investigated as potential candidate genes. 5000 EST sequences were generated and analyzed representing 1573 individual transcripts, corresponding to known (1400) and to novel, yet uncharacterized genes (173). About 7% of the proteins were already described in cartilage/ bone development or homeostasis, showing that the generated library is tissue specific. The remaining profile of this library was compared to previously published libraries from different time points (8th–12th, 18th–20th week and adult human cartilage) that also showed a similar distribution, reflecting the quality of the presented library analyzed. Furthermore, three potential candidate genes (LRRC59, CRELD2, ZNF577) were further investigated and their potential involvement in skeletogenesis was discussed. Secondly, a disease-orientated approach was undertaken to identify downstream targets of LMX1B, the gene causing Nail-Patella syndrome (NPS), and to investigate similar conditions. Like NPS, Genitopatellar syndrome (GPS) is characterized by aplasia or hypoplasia of the patella and renal anomalies. Therefore, six GPS patients were enrolled in a study to investigate the molecular changes responsible for this relatively rare disease. A 3.07 Mb deletion including LMX1B and NR5A1 (SF1) was found in one female patient that showed features of both NPS and GPS and investigations revealed a 46,XY karyotype and ovotestes indicating true hermaphroditism. The microdeletion was not seen in any of the five other patients with GPS features only, but a potential regulatory element between the two genes cannot be ruled out yet. Since Lmx1b is expressed in the dorsal limb bud and in podocytes, proteomic approaches and expression profiling were performed with murine material of the limbs and the kidneys to identify its downstream targets. After 2D-gel electrophoresis with protein extracts from E13.5 fore limb buds and newborn kidneys of Lmx1b wild type and knock-out mice and mass spectrometry analysis, only two proteins, agrin and carbonic anhydrase 2, remained of interest, but further analysis of the two genes did not show a transcriptional down regulation by Lmx1b. The focus was switched to expression profiles and RNA from newborn Lmx1b wild type and knock-out kidneys was compared by microarray analysis. Potential Lmx1b targets were almost impossible to study, because of the early death of Lmx1b deficient mice, when the glomeruli, containing podocytes, are still immature. Because Lmx1b is also expressed during limb development, RNA from wild type and knock-out Lmx1b E11.5 fore limb buds was investigated by microarray, revealing four potential Lmx1b downstream targets: neuropilin 2, single-stranded DNA binding protein 2, peroxisome proliferative activated receptor, gamma, co-activator 1 alpha, and short stature homeobox 2. Whole mount in situ hybridization strengthened a potential down regulation of neuropilin 2 by Lmx1b, but further investigations including in situ hybridization and protein-protein interaction studies will be needed.
Im Jahr 2007 waren 372 Osteochondrodysplasien und genetisch bedingte Dysostosen bekannt [Superti-Furga and Unger, 2007]. Für 215 dieser Erkrankungen konnte eine Assoziation mit einem oder mehreren Genen hergestellt werden, während die molekularen Veränderungen für die verbleibenden Syndrome weiterhin unbekannt bleiben. Die vorliegende Dissertation sollte daher zur Identfizierung neuer Gene führen, die in Prozesse der Knorpel- und Knochenentwicklung, des Wachstums, der Differenzierung und der Homöostase involviert sind und so als Kandidatengene für die zuvor erwähnten Erkrankungen in Frage kommen könnten. Zwei verschiedene Ansätze wurden verfolgt. Zuerst wurde ein Hochdurchsatz Sequenzierprojekt mit einer humanen, fetalen Knorpelbank durchgeführt, um neue Gene in der frühen Skelettentwicklung (20. Schwangerschaftswoche bis 2. Lebensjahr) zu identifizieren, die als potentielle Kandidatengene weiter untersucht werden sollten. 5000 EST Sequenzen, die 1573 individuelle Transkripte repräsentierten, wurden generiert und analysiert. Unter den 1573 befanden sich 1400 bekannte und 173 neue, bisher uncharakterisierte individuelle Transkripte. 7 % der Proteine waren bereits in der Knorpel-/ Knochenentwicklung oder Homöostase beschrieben, was die Gewebsspezifität der generierten Bank auswies. Die restlichen Verteilungen der Transkripte innerhalb der Bank wurden mit Veröffentlichungen über andere Banken (8.-12. Schwangerschaftswoche, 18.-20. Schwangerschaftswoche, und adulter Knorpel) verglichen. Es zeigte sich eine ähnliche Verteilung, was für die Qualität der Bank spricht. Drei potentielle Kandidatengene (LRRC59, CRELD2, ZNF577) wurden eingehend bearbeitet und ihre mögliche Rolle in der Skelettentwicklung diskutiert. Zweitens wurde ein krankheitsorientierter Ansatz durchgeführt, um Zielgene für LMX1B, das mit dem Nagel-Patella Syndrom ( NPS) assoziiert wurde, zu identifizieren und ähnliche Syndrome zu untersuchen. Wie NPS wurde auch das Genitopatellare Syndrome (GPS) mit apo- oder hypoplastischen Kniescheiben und Anomalien der Nieren beschrieben. Daher wurden 6 GPS Patienten in einer Studie auf molekulare Veränderungen hin untersucht, die für das Syndrom verantwortlich sein könnten. Eine 3.07 Mb Deletion, die die Gene LMX1B und NR5A1/ SF1 umfasste, wurde in einem weiblichen Patienten mit Merkmalen des GPS und des NPS gefunden, bei der ein 46,XY Karyotyp, Ovotestis und damit Hermaphroditismus gefunden wurden. Die Mikrodeletion konnte in keinem der 5 anderen GPS Patienten gefunden werden, aber ein potentielles regulatorisches Element zwischen den beiden Genen kann bisher nicht ausgeschlossen werden. Da Lmx1b im dorsalen Teil der Extremitätenknospen und in Podozyten exprimiert wird, wurden unterschiedliche Versuche auf Protein- und RNA Ebene durchgeführt, die zur Identifizierung von Lmx1b Zielgenen in murinen Extremitäten und Nieren führen sollte. Nach einer 2D-Gelelektrophorese mit Proteinextrakten von E13,5 Vorderextremitäten und neugeborenen Nieren von wildtyp und mutanten Lmx1bMäusen, wurden potentielle Kandidaten per anschliessender Massenspektrometrie identifiziert. Nur zwei Proteine, Agrin und Carbonic Anhydrase 2, wurden bei diesen Experimenten gefunden. Aber eine weitere Analyse zeigte keine transkriptionelle Regulation durch Lmx1b. Daher wurden direkt Mikroarray Versuche mit RNA von neugeborenen Lmx1b wildtyp und mutanten Nieren durchgeführt. Die potentiellen Lmx1b Zielgene liessen sich nicht weiter untersuchen, da zum Zeitpunkt des Todes die Glomerulireifung noch nicht abgeschlossen ist und die Podozyten daher nicht untersucht werden konnten. Da Lmx1b auch während der Extremitätenentwicklung exprimiert wird, wurde des weiteren RNA von wildtyp und mutanten Lmx1b E11,5 Vorderextremitäten per Mikroarray Analyse untersucht und 4 potentielle Lmx1b Zielgene wurden identifiziert: Single-stranded DNA binding protein 2, neuropilin 2, peroxisome proliferative activated receptor, gamma, co-activator 1 alpha und short stature homeobox 2. Whole mount in situ Hybridisierung bestätigte die Herabregulierung von Neuropilin 2 durch Lmx1b, aber weitere Untersuchungen wie In situ Hybridisierung und Studien der Protein-Protein-Interaktionen stehen weiterhin aus.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-1705
URN: urn:nbn:de:hebis:77-14894
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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