Authors:	Fuchs, Christine
Title:	Das Globingen-Repertoire von Amphibien und Teleostiern
Online publication date:	15-Jan-2008
Year of first publication:	2008
Language:	german
Abstract:	Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde die molekulare Evolution von Globinen in Amphibien und Teleostiern untersucht und Analysen zur Genexpression ausgewählter Globine durchgeführt. Die bisher besonders für die neueren Mitglieder der Superfamilie der Globine – Neuroglobin und Cytoglobin – schwerpunktmäßig in Mammaliern erbrachten Daten sollten durch die Analyse in Amphibien und Teleostiern auf ihre generelle Gültigkeit für Vertebraten überprüft werden. Die Analysen zur Genexpression wurden sowohl in silico, basierend auf genomischen wie EST-Daten, als auch experimentell durch qualitative und quantitative RT-PCR-Nachweise durchgeführt. Die mRNA-Lokalisation wurde durch in situ-Hybridisierungen an Gewebeschnitten beziehungsweise durch Whole mount in situ-Hybridisierung an ganzen Embryonen detektiert. In einem ersten Teil der Arbeit wurde das Globin-Repertoire von Xenopus tropicalis umfassend analysiert. Die Expressionsanalyse der gefundenen Globine umfasste nicht nur adulte Tiere, sonder erstmals auch detailliert die Entwicklungsstadien eines Vertebraten. Dabei wurde festgestellt, dass die vorwiegend neuronale Expression des streng konservierten Neuroglobins ein generelles Charakteristikum aller Tetrapoden ist und bereits in der frühembryonalen Entwicklung auftritt. Auch für das als Einzelkopie im Amphibiengenom vertretene Cytoglobin konnte eine strenge Sequenzkonservierung gezeigt werden. Das Expressionsmuster des Amphibien-Cytoglobins stimmte mit dem aus Mammaliern bekannten überein und zeigte konservierte Charakteristika dieses Globins bei Tetrapoden auf. Die Analyse des Xenopus-Genoms ergab zudem, dass Krallenfrösche nicht über Myoglobin verfügen. Genomische Vergleiche syntäner Genregionen ließen auf Rearrangements in diesem Genombereich im Verlauf der Evolution schließen, in deren Folge das Myoglobingen in den Krallenfröschen deletiert wurde. Die Hämoglobine wurden in Xenopus tropicalis erstmals in einem Amphibium umfassend analysiert. Die Gene zeigten demnach eine geclusterte Anordnung: der tropische Krallenfrosch verfügte über je ein funktionelles α- bzw. β-adultes und sieben bzw. vier α- bzw. β-larvale Hämoglobine, die während der Entwicklung bzw. in adulten Tieren charakteristisch exprimiert wurden. Die Analyse der Hämoglobine hinsichtlich ihrer Lage in einem Cluster, ihrer phylogenetischen Relation zueinander und nicht zuletzt ihres Expressionsmusters ließen Rückschlüsse auf ihre Evolution zu. Zusätzlich zu diesen bereits bekannten Globinen konnte im Rahmen dieser Dissertation das Globingen-Repertoirs von Xenopus um zwei weitere, bisher unbekannte Globine erweitert werden. Diese wurden entsprechend ihrer bisher unbekannten Funktion als GlobinX und GlobinY bezeichnet. Während GlobinY bisher ausschließlich in Amphibien nachgewiesen werden konnte, wurde GlobinX zudem in Teleostiern detektiert und repräsentiert damit ein auf Anamnia beschränktes Globin. Die rekombinante Proteinexpression von Neuroglobin, Cytoglobin, GlobinX und GlobinY des tropischen Krallenfrosches zeigte ein hexakoordiniertes Bindungsschema dieser Globine in ihrem Deoxy-Zustand. In einem zweiten Teil dieser Dissertation wurden Neuroglobin und Cytoglobin in Teleostiern untersucht und die Analyse für diese zwei Gene somit über die Tetrapoden hinaus auf den gesamten Stammbaum der Vertebraten ausgedehnt. Dabei wurde deutlich, dass die vorwiegend neuronale Expression des seit 420 Millionen Jahren streng konservierten Neuroglobins ein generelles Merkmal dieses Globins in allen Vertebraten ist. Der in Amphibien und Teleostiern erbrachte und mit Ergebnissen in Mammaliern übereinstimmende Nachweis von Neuroglobin in neuronalen Geweben mit einem hohen Stoffwechsel lässt derzeit eine Funktion dieses Globins im Sauerstoffmetabolimus als wahrscheinlich erscheinen. Ob Neuroglobin dabei als kurzzeitiger Sauerstoffspeicher, O2-Transoprter oder aber in der Detoxifikation reaktiver Sauerstoff- bzw. Stickstoffspezies agiert, bleibt zu untersuchen. Für Cytoglobin konnte eine offenbar alle Teleostier betreffende Genduplikation nachgewiesen werden. Phylogenetische Analysen zeigen die Monophylie der Vertebraten-Cytoglobine. Der Vergleich der paralogen Cytoglobine der Teleostier mit dem syntänen Genombereich des humanen Cytoglobins zeigte die wahrscheinliche Entstehung der Fisch-Cytoglobine durch eine Genomduplikation in einem Vorfahren aller Teleostier vor etwa 300-450 Millionen Jahren. Die paralogen Cytoglobine zeigten in Danio rerio und Tetraodon nigroviridis differierende, charakteristische Expressionsmuster, die mit der Theorie der Subfunktionalisierung von Genen in Folge eines Duplikationsereignisses kompatibel sind. Die Analyse zeigte, dass Cygb-1 prädominant in Gehirn und Herz exprimiert wurde, Cygb-2 hingegen bevorzugt in Gehirn und Auge. Dies bestätigte indirekt die Hypothese, nach der das Cytoglobin der Mammalier zwei unterschiedliche Funktionen in differenten Geweben wahrnimmt. Die rekombinante Expression von Cygb-1 des Zebrabärblings zeigte zudem, das auch dieses Globin in seiner Deoxy-Form über ein hexakoordiniertes Bindungsschema verfügt. In the context of this doctoral thesis the molecular evolution of amphibian and teleost globins was examined and the expression of selected globin genes was analyzed. The characterization of the new globin family members – Neuroglobin and Cytoglobin – was hitherto focused on mammals and should here be verified in regard of its validity for vertebrates. The gene expression analyses have been carried out in silico, based on genomic and EST data, and were experimentally analyzed by qualitative and quantitative RT-PCR. The localization of mRNA was detected via in-situ hybridizations in cryosections and whole embryos, respectively. In a first section, the Xenopus tropicalis globin repertoire was globally analyzed. The expression analyses of located globins not only included adult animals but for the first time different development stages of a vertebrate in detail. The predominant neuronal expression of neuroglobin, whose sequence is strongly conserved, was detected as a general feature of all tetrapods and could be found even in very early developmental stages. Cytoglobin was also detected as a highly conserved single copy gene within the amphibian genome. The expression profile of Cytoglobin in amphibians corresponded to the mammalian one and showed conserved characteristics of this globin in tetrapods. Moreover, the genome analysis revealed that Xenopus exhibits no myoglobin. Genomic analyses of syntenic regions suggested genomic rearrangements during evolution, leading to the deletion of the myoglobin gene in Xenopus. For the first time, the hemoglobins were widespreadly analyzed in an amphibian. These genes showed a clustered arrangement: Xenopus tropicalis possessed one functional - and -adult and seven -and four -larval hemoglobin genes, respectively, which were expressed characteristically in larval and adult animals. The position in one cluster, the phylogenetic relationship and the expression patterns of the hemoglobin genes gave insight into their evolution. Additionally to the hitherto known globin genes, two so far unknown globin genes could be detected in the genome of Xenopus tropicalis. According to their previously unknown function, these genes were termed as GlobinX and GlobinY, respectively. Whereas GlobinY was exclusively detected in amphibians up to now, GlobinX was also demonstrated to be expressed in teleosts but not mammalians and is therefore restricted to anamnia. The recombinant protein expression of Neuroglobin, Cytoglobin, GlobinX and GlobinY of Xenopus tropicalis revealed a hexacoordinated binding scheme of these deoxy-globins. In a second section, this doctoral thesis examined Neuroglobin and Cytoglobin in teleosts, which expanded the analysis of these two globin genes to obtain a generalized picture for all vertebrates. It became apparent, that the predominant neuronal expression of the strongly conserved Neuroglobin was a general characteristic of all vertebrates. The detection of Neuroglobin in amphibians and teleosts corresponds to the results shown in mammals, where the globin is found predominantly in neuronal tissues with a high metabolic rate. This possibly suggests a function of Neuroglobin in the oxygen metabolism, but it currently remains to be analyzed weather Neuroglobin acts as short term oxygen store, oxygen transporter or if it has a role in the detoxification of reactive oxygen or nitric species. Cytoglobin was shown to be duplicated in apparently all teleosts. Phylogenetic analyses revealed the vertebrate Cytoglobins to be monophyletic. Comparisons of paralogous teleost Cytoglobins with the corresponding syntenic region of human Cytoglobin detected the possible origin of teleost Cytoglobins as a result of a genome duplication in a teleost ancestor 300-450 million years ago. The paralogous Cytoglobin genes of Danio rerio and Tetraodon nigroviridis revealed different and characteristic expression profiles in agreement with the theory of subfunctionalization of genes following a genome duplication event. Cytoglobin-1 (Cygb-1) was predominantly expressed in brain and heart, whereas Cytoglobin-2 (Cygb-2) was mainly found in brain and eye. This finding confirmed indirectly the hypothesis that the mammalian Cytoglobin possesses two different functions in distinct tissues. Furthermore, the recombinant expression of zebrafish Cygb-1 revealed a hexacoordination for the deoxy form of the protein.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1696
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-14746
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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