Authors:	Copanaki, Ekaterini
Title:	Modulation der Genexpression und des neuronalen Zelltods durch das Amyloid-Vorläufer-Protein (APP)
Online publication date:	19-Nov-2007
Year of first publication:	2007
Language:	german
Abstract:	Das Amyloid-Vorläufer-Protein (APP) spielt eine zentrale Rolle in der Entstehung und Entwicklung von Morbus Alzheimer. Hierbei ist die proteolytische Prozessierung von APP von entscheidender Bedeutung. Das Verhältnis von neurotoxischen und neuroprotektiven Spaltprodukten, die über den amyloidogenen und nicht-amyloidogenen Weg der APP-Prozessierung gebildeten werden, ist für das Überleben von Neuronen und deren Resistenz gegen zytotoxische Stress-Stimuli von hoher Relevanz. Störungen der Calcium-Homöostase sind ein bekanntes Phänomen bei Morbus Alzheimer. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von überexprimiertem APP in der Regulation des neuronalen Zelltods nach Calcium Freisetzung untersucht. Die Calcium Freisetzung aus dem endoplasmatischen Retikulum wurde durch die Inhibition der sarko- und endoplasmatischen Calcium-ATPasen (SERCA) ausgelöst. Dies führt zur Induktion der sogenannten „unfolded protein response“ (UPR) und zu einer Aktivierung von Effektor-Caspasen. Für APP-überexprimierende PC12 Zellen konnte bereits zuvor eine im Vergleich zur Kontrolle nach der durch Calcium Freisetzung-induzierten Apoptose eine erhöhte intrazelluläre Calcium Konzentration nachgewiesen werden. Über die Messung der Aktivierung von Effektor-Caspasen konnte zudem ein gesteigerter Zelltod in den APP-überexprimierenden Zellen gemessen werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass der pro-apoptotische Transkriptionsfaktor CHOP, nicht aber die klassischen UPR-Zielgene spezifisch hochreguliert wurden. Die APP-modulierte gesteigerte Induktion von Apoptose nach Calcium Freisezung konnte durch Komplexierung der intrazellulären Calcium Ionen und durch Knockdown von CHOP im Vergleich zur Kontrolle gänzlich unterdrückt werden. Ferner bewirkte die Inhibition der Speicher-aktivierten Calcium-Kanälen (SOCC) eine signifikante Unterdrückung der beobachteten erhöhten intrazellulären Calcium Konzentration und der gesteigerten Apoptose in den APP-überexprimierenden PC12 Zellen. In diesem Teil der Arbeit konnte eindeutig gezeigt werden, dass APP in der Lage ist den durch Calcium-Freisetzung-induzierten Zelltod zu potenzieren. Diese Modulation durch APP verläuft in einer UPR-unabhängigen Reaktion über die Aktivierung von SOCC’s, einer erhöhten Aufnahme von extrazellulärem Calcium und durch erhöhte Induktion des pro-apoptotischen Transkriptionsfaktors CHOP. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die sAPPα-vermittelte Neuroprotektion untersucht. Dabei handelt es sich um die N-terminale Ektodomäne von APP, die über die Aktivität der α-Sekretase prozessiert wird und anschließend extrazellulär abgegeben wird. Ziel dieser Versuchsreihe war die neuroprotektive physiologische Funktion von APP im Hinblick auf den Schutz von neuronalen Zellen vor diversen für Morbus Alzheimer relevanten Stress-Stimuli bzw. Apoptose-Stimuli zu untersuchen. Durch die Analyse der Effektor-Caspasen konnte gezeigt werden, dass sAPPα in der Lage ist PC12 Zellen potent vor oxidativem Stress, DNA-Schäden, Hypoxie, proteasomalem Stress und Calcium-Freisetzung zu schützen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass sAPPα in der Lage ist den pro-apoptotischen Stress-induzierten JNK/Akt-Signalweg zu inhibieren. Eine Beteiligung des anti-apoptotischen PI3K/Akt-Signalwegs bei der sAPPα-vermittelten Protektion konnte über die Inhibition der PI3-Kinase ebenfalls demonstriert werden, die eine Aufhebung der sAPPα-vermittelten Neuroprotektion bewirkte. Diese Daten zeigen neue molekulare Mechanismen auf, die dem sAPPα-vermittelten Schutz vor pathophysiologisch relevanten Stress-Stimuli in neuronalen Zellen zugrunde liegen. Im letzten Teil der Arbeit wurden verschieden Gruppen von pharmakologischen Substanzen im Hinblick auf ihre neuroprotektive Wirkung untersucht und mit ihren Effekten auf den APP-Metabolismus korreliert. Die Untersuchungen ergaben, dass Galantamin, ein schwacher Acetycholinesterase Inhibitor und allosterisch potenzierender Ligand von nikotinischen Acetylcholin-Rezeptoren in der Lage war, naive, und mit noch höherer Effizienz APP-überexprimierende Zelllinien vor dem Stress-induzierten Zelltod zu schützen. Zudem bewirkte Galantamin in APP-überexprimierenden HEK293 Zellen eine rasche Erhöhung der sAPPα Sekretion, so dass hier von einer Rezeptor-vermittelten Modulation des APP Metabolismus ausgegangen werden kann. Omega-3 Fettsäuren wirken sich positiv auf die Membranfluidität von Zellen aus und es konnte bereits gezeigt werden, dass die Bildung des toxischen Aβ Peptids hierdurch vermindert wird. In Analogie zu Galantamin schützte die Omega-3 Fettsäure Docosahexaensäure (DHA) neuronale Zellen vor dem Stress-induzierten Zelltod, wobei der Schutz in APP-überexprimierenden Zellen besonders effizient war. Diese Daten legen nahe, dass die Aktivierung des antiamyloidogenen Wegs der APP-Prozessierung ein viel versprechender Ansatz für die Entwicklung neuer Therapien gegen Morbus Alzheimer sein könnte. The Amyloid Precursor Protein (APP) and its metabolism play fundamental roles in the pathophysiology of Alzheimer’s disease. The ratio of neurotoxic and neuroprotective cleavage products, which are produced via the so called amylogenic and antiamylogenic pathways, determine the survival of neurons and their resistance against cytotoxic stress stimuli. Disturbance of cellular calcium homeostasis is a known phenomenon in Alzheimer’s disease. The first part of this thesis focussed on the effect of non-secreted, overexpressed APP in the regulation of neuronal cell death after calcium store depletion. Calcium store depletion of the endoplasmic reticulum (ER) was induced by the SERCA (Sarco/Endoplasmic Reticulum Calcium ATPase) inhibitor thapsigargin. This led to a rapid induction of the unfolded protein response (UPR) and a delayed activation of executioner caspases in the cultures. Overexpression of APP potently enhanced cytosolic calcium levels and cell death after ER calcium store depletion in comparison to vector-transfected controls. Microarray and RT-PCR analysis revealed that the expression of classical UPR chaperone genes was not altered by overexpression of APP. Interestingly, the induction of the ER stress-responsive pro-apoptotic transcription factor CHOP was significantly upregulated in APP-overexpressing cells in comparison to vector-transfected controls. Prevention of CHOP induction by chelation of intracellular calcium and by RNA interference was able to abrogate the potentiating effect of APP on thapsigargin-induced apoptosis. Application of store-operated channel (SOC)-inhibitors downmodulated APP-triggered potentiation of cytosolic calcium levels and apoptosis after treatment with thapsigargin. These data demonstrate that APP significantly modulates calcium store depletion-induced cell death in a SOC- and CHOP-dependent manner, but independent of the UPR. Under physiological conditions, the majority of APP is processed via the anti-amyloidogenic pathway, thus leading to the generation of the secreted cleavage product sAPPα. In the second part of this thesis the sAPPα-mediated neuroprotective effects of the N-terminal ectodomaine of APP were investigated. The aim of these studies was to elucidate the neuroprotective physiological function of APP and its secreted N-terminal fragment sAPPα in the control of stress signalling and apoptosis. Analyses of executioner caspases demonstrate a potent neuroprotective effect of sAPPα in rat PC12 cells. sAPPα was able to protect PC12 cells from apoptosis induced by proteasome inhibition, oxidative stress, hypoxia, DNA damage and calcium store depletion, and downmodulated stress-induced phosphorylation of JNKs. It also could be shown that sAPPα is able to inhibit activation of the pro-apoptotic JNK/c-Jun signalling pathway. Application of pharmacological inhibitors demonstrated that the anti apoptotic PI3K/Akt pathway was involved in sAPPα mediated neuroprotection. These data shed new light on the molecular mechanisms underlying the sAPPα-mediated neuroprotective effects against pathophysiologically relevant stress stimuli. In the last part of this thesis, different groups of pharmacologic substances were investigated in regard of their neuroprotective effects and the correlation of these effects with alterations in the metabolism of APP. Galantamine, a weak cholinesterase blocker and potent nicotinic allosteric potentiating ligand of nicotinic ACh receptors, was able to protect naive and even more potently APP overexpressing cell lines against stress-induced cell death. Furthermore, galantamine was able to increase secretion of sAPPα in APP overexpressing HEK293 cells. These data suggest receptor-mediated modulation of the APP metabolism by galantamine. Omega-3 fatty acids are membrane fluidity enhancers leading to a decrease of endogenous Aβ peptide production. Similiar to galantamine, the omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid (DHA) protected neuronal cells from stress-induced cell death, with the protective effect being especially potent in APP overexpressing cells. These data suggest that activation of the antiamyloidogenic pathway of APP processing might be a very promising approach for the development of novel therapies for Alzheimer´s disease.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1689
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-14517
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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