Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-1669
Authors: Distler, Eva
Title: In vitro generation and characterization of acute myeloid leukemia-reactive CD8 + cytotoxic T-lymphocyte clones from healthy donors
Online publication date: 15-Oct-2007
Year of first publication: 2007
Language: english
Abstract: Donor-derived CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) eliminating host leukemic cells mediate curative graft-versus-leukemia (GVL) reactions after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). The leukemia-reactive CTLs recognize hematopoiesis-restricted or broadly expressed minor histocompatibility and leukemia-associated peptide antigens that are presented by human leukocyte antigen (HLA) class I molecules on recipient cells. The development of allogeneic CTL therapy in acute myeloid leukemia (AML) is hampered by the poor efficiency of current techniques for generating leukemia-reactive CTLs from unprimed healthy donors in vitro. In this work, a novel allogeneic mini-mixed lymphocyte/leukemia culture (mini-MLLC) approach was established by stimulating CD8+ T cells isolated from peripheral blood of healthy donors at comparably low numbers (i.e. 10e4/well) with HLA class I-matched primary AML blasts in 96-well microtiter plates. Before culture, CD8+ T cells were immunomagnetically separated into CD62L(high)+ and CD62L(low)+/neg subsets enriched for naive/central memory and effector memory cells, respectively. The application of 96-well microtiter plates aimed at creating multiple different responder-stimulator cell compositions in order to provide for the growth of leukemia-reactive CTLs optimized culture conditions by chance. The culture medium was supplemented with interleukin (IL)-7, IL-12, and IL-15. On day 14, IL-12 was replaced by IL-2. In eight different related and unrelated donor/AML pairs with complete HLA class I match, numerous CTL populations were isolated that specifically lysed myeloid leukemias in association with various HLA-A, -B, or -C alleles. These CTLs recognized neither lymphoblastoid B cell lines of donor and patient origin nor primary B cell leukemias expressing the corresponding HLA restriction element. CTLs expressed T cell receptors of single V-beta chain families, indicating their clonality. The vast majority of CTL clones were obtained from mini-MLLCs initiated with CD8+ CD62L(high)+ cells. Using antigen-specific stimulation, multiple CTL populations were amplified to 10e8-10e10 cells within six to eight weeks. The capability of mini-MLLC derived AML-reactive CTL clones to inhibit the engraftment of human primary AML blasts was investigated in the immunodeficient nonobese diabetic/severe combined immune deficient IL-2 receptor common γ-chain deficient (NOD/SCID IL2Rγnull) mouse model. The leukemic engraftment in NOD/SCID IL2Rγnull was specifically prevented if inoculated AML blasts had been pre-incubated in vitro with AML-reactive CTLs, but not with anti-melanoma control CTLs. These results demonstrate that myeloid leukemia-specific CTL clones capable of preventing AML engraftment in mice can be rapidly isolated from CD8+ CD62L(high)+ T cells of healthy donors in vitro. The efficient generation and expansion of these CTLs by the newly established mini-MLLC approach opens the door for several potential applications. First, CTLs can be used within T cell-driven antigen identification strategies to extend the panel of molecularly defined AML antigens that are recognizable by T cells of healthy donors. Second, because these CTLs can be isolated from the stem cell donor by mini-MLLC prior to transplantation, they could be infused into AML patients as a part of the stem cell allograft, or early after transplantation when the leukemia burden is low. The capability of these T cells to expand and function in vivo might require the simultaneous administration of AML-reactive CD4+ T cells generated by a similar in vitro strategy or, less complex, the co-transfer of CD8-depleted donor lymphocytes. To prepare clinical testing, the mini-MLLC approach should now be translated into a protocol that is compatible with good manufacturing practice guidelines.
Nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation vermitteln CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten (cytotoxic T lymphocytes, CTL) des Donors durch Eliminierung leukämischer Zellen im Empfänger kurative Graft-versus-Leukemia (GvL) Effekte. Die Leukämie-reaktiven CTL erkennen Hämatopoese-restringierte oder breit exprimierte Minor-Histokompatibilitäts- und Leukämie-assoziierte Peptidantigene, die von Humanes Leukozyten Antigen (HLA) Klasse I Molekülen auf Empfängerzellen exprimiert werden. Die Entwicklung einer allogenen CTL Therapie für die Akute Myeloische Leukämie (AML) wird durch die schlechte Effizienz derzeitiger in vitro Techniken zur Generierung Leukämie-reaktiver CTL aus gesunden Spendern erschwert. In dieser Arbeit wurde eine neue allogene gemischte Lymphozyten- Leukämiezell-Kultur (Mini-mixed lymphocyte/leukemia culture, Mini-MLLC) etabliert, mit der AML-reaktive CD8+ CTL aus naiven Blutspendern effektiv in vitro generiert und expandiert werden können. Als Responderzellen wurden CD8+ T-Zellen des peripheren Bluts gesunder Spender eingesetzt, die immunomagnetisch in CD62L(high)+ und CD62L(low)+/neg Fraktionen separiert wurden, welche T-Zellen des naiven und central memory bzw. des effector memory Kompartiments enthalten. Diese wurden in 96 well-Rundbodenplatten in vergleichsweise niedriger Zellzahl (10e4/well) mit HLA Klasse I-identischen primären AML Blasten stimuliert. Die Verwendung von 96 well-Rundbodenplatten hatte zum Ziel, eine Vielzahl verschiedener, zufälliger Responder-Stimulator-Zell-Kombinationen zu ermöglichen, um optimierte Kulturbedingungen für das Wachstum Leukämie-reaktiver CTL zu schaffen. Den Kulturen wurde Interleukin (IL)-7, IL-12 und IL-15 zugegeben; an Tag 14 wurde IL-12 durch IL-2 ersetzt. In acht verwandten und unverwandten Donor/AML Kombinationen mit kompletter HLA Klasse I Übereinstimmung konnten zahlreiche CTL Populationen isoliert werden, die spezifisch myeloische Leukämien lysierten und über verschiedene HLA-A, -B oder C-Allele restringiert waren. Diese CTL erkannten weder lymphoblastoide B-Zelllinien des Donor oder des Patienten, noch primäre B-Zell-Leukämien die das jeweilige HLA-Restriktionsallel exprimierten. Die CTL exprimierten T-Zellrezeptoren einzelner V-beta Kettenfamilien; dies zeigte, dass die AML-reaktiven CTL aus klonalen Vorläuferzellen abstammen. Die überwiegende Mehrheit an CTL Klonen wurde aus Mini-MLLC generiert, die mit CD8+ CD62L(high)+ gestartet wurden. Durch Antigen-spezifische Stimulation wurden mehrere CTL Populationen auf 10e8 bis10e10 Zellen innerhalb von sechs bis acht Wochen expandiert. Die Fähigkeit der durch Mini-MLLC generierten AML-reaktiven CTL Klone, das Anwachsen von humanen primären AML Blasten zu verhindern, wurde im immundefizienten NOD/SCID IL2Rgammanull (nonobese diabetic/severe combined immune deficient IL-2 receptor common gamma-chain deficient) Mausmodell untersucht. Das Anwachsen der Leukämie in NOD/SCID IL2Rgammanull Mäusen wurde spezifisch verhindert, wenn die injizierten AML Blasten zuvor in vitro mit AML-reaktiven CTL vorinkubiert wurden, jedoch nicht bei Vorinkubation mit Melanom-reaktiven Kontroll-CTL. Diese Ergebnisse zeigen, dass myeloische Leukämie-reaktive CTL, die ein AML-Anwachsen in Mäusen verhindern, effizient aus CD8+ CD62L(high)+ T-Zellen gesunder Spender in vitro isoliert werden können. Die effiziente Generierung und Expansion dieser CTL durch die neu entwickelte Mini-MLLC Methode ermöglicht mehrere potentielle Anwendungen. Zum einen können die CTL zur Identifikation von T-Zell-definierten Antigenen eingesetzt werden, um die Anzahl an molekular definierten AML Antigenen, die von T-Zellen gesunder Spender erkannt werden, zu erweitern. Da es möglich ist, diese CTL bereits vor dem Zeitpunkt der Transplantation durch Mini-MLLC aus dem Stammzellspender zu isolieren, könnten sie als Teil des Transplantats in den AML Patienten transferiert werden, oder zu frühen Zeitpunkten nach Transplantation, wenn die Leukämielast gering ist. Die Fähigkeit dieser T-Zellen in vivo zu expandieren und Effektorfunktionen zu vermitteln, erfordert möglicherweise die gleichzeitige Gabe von AML-reaktiven CD4+ T-Zellen, die durch eine ähnliche in vitro Methode generiert werden könnten, oder den Co-Transfer von CD8-depletierten Donorlymphozyten. Zur Vorbereitung einer klinischen Testung soll die Mini-MLLC Methode nun in ein Protokoll translatiert werden, welches den Richtlinien der Guten Herstellungspraxis (good manufacturing practice, GMP) entspricht.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-1669
URN: urn:nbn:de:hebis:77-14197
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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