Authors:	Selmi, Abderraouf
Title:	Induktion und Analyse spezifischer Immunantworten nach intranodaler Immunisierung mit RNA im murinen Modell
Online publication date:	15-Oct-2007
Year of first publication:	2007
Language:	german
Abstract:	Die Wirksamkeit einer Vakzine ist von vielen Parametern abhängig. Dazu gehören unter anderen: das ausgewählte Antigen, die Formulation in der das Antigen benutzt wird sowie die Applikationsroute. Antigen-kodierende Ribonukleinsäuren (RNA) gilt heutzutage als eine sichere und effiziente Alternative zu traditionellen Impfstoff-Formulierungen, wie Peptiden, rekombinanten Proteinen, viralen Systemen oder DNA basierten Impfstoffen. Bezüglich des Applikationsortes repräsentiert der Lymphknoten ein optimales Milieu für die Interaktion zwischen antigenpräsentierenden Zellen und T-Zellen. Vor diesem Hintergrund war die Zielsetzung dieser Arbeit, ein auf direktem in vivo Transfer von Antigen-kodierender in vitro transkribierter RNA (IVT-RNA) basierendes Impfverfahren zu entwickeln, zu charakterisieren und auf seine anti-tumorale Wirksamkeit zu testen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass dendritische Zellen (DCs) in vitro hocheffizient mit IVT-RNA transfiziert werden können und eine hohe stimulatorische Kapazität besitzen. Durch Sequenzmodifikation der IVT-RNA konnten wir die Transkriptstabilität und Translationseffizienz erhöhen was zu einer Steigerung der stimulatorischen Kapazität in vivo führte. Darüber hinaus untersuchten wir die Auswirkung der Insertion eines Signalpeptides 5’ sowie einer C-terminalen transmembran- und zytosolischen-Domäne eines MHC-Klasse-I-Moleküls am 3’ der Antigen-kodierenden Sequenz auf die Effizienz der MHC-Klasse-I und -II Präsentation. Wir konnten in vitro und in vivo nachweisen, dass diese Modifikation zu einer gesteigerten, simultanen Stimulation von antigenspezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen führt. Auf der Basis der optimierten Vektorkassetten etablierten wir die intranodale (i.n.) Transfektion von antigenpräsentierenden Zellen in der Maus. Dazu nutzten wir verschiedene Reportersysteme (eGFP-RNA, fluoreszensmarkierte RNA) und konnten zeigen, dass die intranodale Applikation von IVT-RNA zu selektiven Transfektion und Maturation lymphknotenresidenter DCs führt. Zur Untersuchung der immunologischen Effekte wurden in erster Linie auf Influenza-Hemagglutinin-A und Ovalbumin basierende Modellantigensysteme verwendet. Beide Antigene wurden als Antigen-MHC-Fusionskonstrukte genutzt. Als Responderzellen wurden TCR-transgene Lymphozyten verwendet, die MHC-Klasse-I oder -Klasse-II restringierte Epitope des Influenza-Hemagglutinin-A bzw. des Ovalbumin-Proteins erkennen. Wir konnten in vivo zeigen, dass die intranodale Immunisierung mit IVT-RNA zu einer effizienten Stimulation und Expansion von antigenspezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen in einer dosisabhängigen Weise führt. Funktionell konnte gezeigt werden, dass diese T-Zellen Zytokine sezernieren und zur Zytolyse befähigt sind. Wir waren in der Lage durch repetitive i.n. RNA Immunisierung ein ‚Priming’ CD8+ T-Zellen in naiven Mäusen sowohl gegen virale als auch gegen Tumor assoziierte Antigene zu erreichen. Die geprimten T-Zellen waren befähigt eine zytolytische Aktivität gegen mit spezifischem Peptid beladene Targetzellen zu generieren. Darüber hinaus waren wir in der Lage Gedächtnisszellen expandieren zu können. Abschließend konnten wir in Tumormodellen sowohl in prophylaktischen als auch in therapeutischen Experimenten zeigen dass die i.n. RNA Vakzination die Potenz zur Induktion einer anti-tumoralen Immunität besitzt. The efficiency of a vaccine depends on several parameters such as the type and the form of the antigen used as well as the route of application. Antigen encoding RNA is today considered to be a safe and efficient alternative to traditional protein-, peptide-, virus- or DNA-based vaccine formulations. Concerning the route of application, the lymph nodes represent an optimal milieu for the interaction between antigen presenting cells and T cells. Based on this background, the objective of this doctoral thesis was to establish the intranodal application of naked in-vitro transcribed RNA (IVT RNA) as method for tumor vaccination protocols and to characterize and study its anti-tumoral potency. In this present work, it could be shown that DCs can be highly efficiently transfected in vitro with IVT-RNA and have a high capacity to stimulate T cells. Through modifications of the IVT-RNA sequence, we could increase the transcript stability and the translation efficiency, thus we could enhance the stimulatory capacity in vivo. Furthermore, we investigated the effect of the insertion of a signal peptide to 5’ of antigen coding sequence as well as the insertion of the C-terminal transmembrane and cytosolic domain of MHC class I molecule 3’ of the antigen coding sequence on the efficiency of MHC class I and MHC class II presentation. We could in vitro and in vivo demonstrate that this modification resulted in an increased and simultaneous stimulation of antigen specific CD4+ and CD8+ T cells. Based on these optimized vector cassettes, we established the intranodal transfection of antigen presenting cells in the mouse. For these purpose, we used different reporter systems: eGFP, fluorescence labelled RNA (Cy3/Cy5-RNA) and we could show that the intranodal application of naked IVT-RNA leads to the selective transfection and maturation of lymph node resident DCs. For immunological studies, influenza hemaglutinin-A and ovalbumin based model antigen systems are predominantly used. As responder cells, we used TCR-transgenic lymphocytes which recognize MHC class I or II restricted epitopes of Influenza hemaglutinin-A and ovalbumin proteins We could also demonstrate in vivo that the intranodal immunization with IVT-RNA leads to efficient stimulation and expansion of antigen specific CD4+ and CD8+ T cells in a dose dependent manner. Functionally, it could be shown that these T cells secrete cytokines and have the capacity to lyse target cells. Through repetitive intranodal IVT-RNA immunization, we were able to prime naïve T cells against viral as well as tumour associated antigens. The primed T cells elicited efficient cytotoxic activity against target cells loaded with the specific peptide. Furthermore, we were able to expand memory cells. Finally, we could show in tumor models that the intranodal RNA vaccination possesses the potential of anti-tumor immunity in both prophylactic and therapeutic experiments.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1668
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-14180
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Appears in collections:	JGU-Publikationen