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Authors: El Bardisy, Shaheer
Title: Development of a High-Throughput Single-Cell Sequencing Platform for the Discovery of Shared-Antigen and Neoepitope-Specific T-Cell Receptors
Online publication date: 3-Jun-2020
Language: english
Abstract: Engineering tumor antigen-specific αβ T-cell receptor (TCR) genes into autologous T cells for adoptive T cell therapy (ACT) has demonstrated prolonged tumor regression in numerous cancers. Clinical advancement of ACT is hindered by the difficulty in retrieving potent and tumor-specific TCRs. Further, the paucity in murine TCR candidates impedes pre-clinical studies needed to advance the clinical success of TCR-based therapies. Despite advances in single cell TCR sequencing (scTCRseq) methods, drawbacks still exist, including low-throughput, high costs and complex protocols. This thesis aimed to develop a high-throughput and easily applicable murine scTCRseq platform to facilitate the discovery of shared tumor antigen and neoepitope-specific murine TCRs. A plate-based scTCRseq platform compatible with next-generation sequencing (NGS) was developed. Sample barcoding permits early pooling of single cell samples and 96-well plate multiplexing allows little hands-on work at a high-throughput. The use of standard laboratory equipment renders the platform easily applicable. Only 25 primers are used and both α and β TCR chains are amplified in the same polymerase chain reaction. An automated data analysis pipeline retrieves αβTCR information from the 2x300 bp paired-end MiSeq data. As an advantage over synthetic gene orders, TCRs of interest can directly be cloned for functional characterization using remaining cDNA. The platform was optimized improving αβTCR detection rates and minimizing platform noise, costs and complexity. Performance evaluation revealed an average paired αβTCR detection rate of 49 %. The scTCRseq platform revealed its superior performance compared to a previously published scTCR cloning platform as well as its ability to provide insight into the TCR repertoire. The scTCRseq platform was applied to establish a library of human and murine HLA-restricted TCRs specific for oncoviral and cancer/testis epitopes, as well as neoantigens. The latter were strictly mutation specific and the majority of the TCRs could recognize the respective tumor cell line. We show that frequent retrieval of the same αβTCR, high read counts and CDR3 homology were indicative of antigen specificity. Moreover, a gene-specific primer panel of commonly used T cell markers was integrated into the platform to allow the additional NGS-based phenotyping of single T cells. This scTCRPhenoSeq platform was applied to determine the phenotype and clonality of chimeric antigen receptor T cells after ACT and subsequent RNA-based in vivo expansion. Together, a powerful tool was developed for the rapid discovery of TA-specific murine TCRs allowing the full exploitation of such TCRs for pre-clinical and clinical advancements of ACT for the benefit of cancer patients.
In ersten Studien hat der adoptive Transfer αβ T-Zell-Rezeptor (TCR) transgener T-Zellen bei zahlreichen Krebsarten zu anhaltenden Tumorregressionen geführt. Der klinische Fortschritt von adoptiven T-Zell-Therapien ist jedoch wesentlich durch die Schwierigkeiten bei der Identifizierung potenter tumorspezifischer TCRs beeinträchtigt. Weiterhin besteht ein Mangel an murinen TCR Kandidaten für die Durchführung notwendiger präklinischer Studien. Trotz der Weiterentwicklung etablierter Einzelzell-TCR-Sequenzierungsverfahren (engl.: scTCRseq) existieren noch immer Schwächen wie ein zu niedriger Durchsatz, zu hohe Kosten und eine sehr hohe Komplexität der Protokolle. Das Ziel dieser Arbeit war deshalb die Entwicklung einer einfach durchzuführenden scTCRseq Plattform zur Identifizierung von murinen TCRs im Hochdurchsatz. Im Anschluss sollte die Plattform eingesetzt werden, um TCRs zu isolieren, die tumorassoziierte (engl.: shared) und tumorspezifische (Neo) Antigene erkennen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde dementsprechend eine Next-Generation Sequencing (NGS) kompatible scTCRseq Plattform im 96-Well-Platten Format entwickelt. Dabei ermöglicht das Einführen von Barcodes sowohl ein frühes Zusammenführen von Einzelzellproben, als auch die Multiplexhandhabung einer Vielzahl von 96-Well-Platten, wodurch ein hoher Durchsatz gewährleistet ist. Darüber hinaus ist die Plattform durch die Verwendung von Standardlaborgeräten einfach zu etablieren und zu handhaben. Innerhalb des Prozesses werden insgesamt lediglich 25 Primer verwendet. Sowohl α als auch β TCR-Ketten werden in der gleichen Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert. Eine automatisierte Datenanalyse-Pipeline ruft αβTCR Informationen aus den gepaarten 2x300 Basenpaaren langen MiSeq Reads ab. Relevante TCR Kandidaten die funktionell charakterisiert werden sollen, können aus der verbliebenen cDNA kloniert werden und müssen nicht kostenintensiv synthetisiert werden. Die Plattform wurde hinsichtlich der αβTCR Erkennungsraten, Reduzierung von Hintergrundsignalen und Komplexität der Plattform, sowie Minimierung der Kosten optimiert. Die Leistungsevaluation ergab eine durchschnittliche Identifikationsrate von 49 % gepaarter αβTCR. Im Vergleich zu einer zuvor veröffentlichten scTCR Klonierungsplattform zeigte die neue scTCRseq Plattform eine verbesserte Lesitungspotential. Sie gewährt zudem Einblicke in das TCR Repertoire. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die scTCRseq Plattform eingesetzt, um eine Bibliothek von humanen und murinen MHC-restringierter TCRs zu etablieren, welche spezifisch onkoretrovirale, Cancer/Testis und Neoantigene erkennen. Letztere waren strikt mutationsspezifisch und für die Mehrheit derselben konnte Tumorzelllinienerkennung gezeigt werden. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass häufiges Auffinden desselben αβTCRs, sowie hohe Readzahlen für einen TCR und CDR3-Homologien mehrerer TCR Kandidaten auf Antigenspezifität hindeuten. Abschließend wurde ein Primer-Panel für häufig verwendete T-Zell-Marker in die Plattform integriert, um zusätzlich die NGS-basierte Phänotypisierung der T-Zellen zu ermöglichen. Diese scTCRPhenoSeq-Plattform wurde nachfolgend eingesetzt, um den Phänotyp und die Klonalität von chimären Antigenrezeptor tragenden (CAR) T-Zellen nach adoptivem Transfer und anschließender RNA-basierter in vivo Expansion zu bestimmen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde somit ein leistungsstarkes Werkzeug für die einfache und schnelle Identifizierung von murinen, tumorspezifischen TCRs entwickelt. Dies legt den Grundstein für die präklinische und klinische Weiterentwicklung, damit letztlich vermehrt hochpotente TCRs für die Immuntherapie von Krebspatienten zur Verfügung stehen.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-1650
URN: urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000035601
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: xi, 113 Seiten
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