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Authors: Zeyen, Lisa Maria
Title: Morphogenese der Hepatitis-B- und Hepatitis-D-Virus-Partikel: Funktionelle Analyse intrazellulärer Transportmechanismen
Online publication date: 2-Jun-2020
Language: german
Abstract: HBV ist eines der erfolgreichsten Pathogene weltweit, u. a. da keine kurative Therapie verfügbar ist. Das Krankheitsbild einer HBV-Infektion manifestiert sich in akuter und chronischer Hepatitis, Leberzirrhose und Leberzellkarzinomen. Eine Koinfektion mit HDV, das auf die HBV-Hüllproteine angewiesen ist, führt zudem zu einem weitaus drastischeren Krankheitsverlauf. Da sich beide Viren durch auffällig kleine Genome auszeichnen, sind Interaktionen zwischen den Pathogenen und zellulären Wirtsfaktoren obligat. Innerhalb dieser Arbeit wurde der Fokus auf die Analyse intrazellulärer Transportmechanismen hinsichtlich möglicher Funktionen in der Pathogenese beider Viren gelegt. Zu diesem Zweck wurden subvirale HDV-Partikel generiert und mittels Immunpräzipitation und Immunfluoreszenz hinsichtlich ihrer morphologischen und sekretorischen Abhängigkeit von HBV.S charakterisiert. Drei Transportmaschinerien, ESCRT, Clathrin- und COPII-vermittelter Vesikeltransport, wurden mittels siRNA-Interferenzen und Hemmung durch Chemikalien oder durch Verwendung dominant-negativer Mutanten mit Methoden der Immunfluoreszenz, Immunpräzipitation und subzellulären Fraktionierung hinsichtlich ihrer Funktionen im Lebenszyklus von HBV und HDV untersucht. ESCRT scheint für die Sekretion von HDV-SVPs nicht benötigt zu sein und zeigte nur tendenziell Einfluss auf die Morphogenese dieser Partikel. Clathrin erwies sich als funktionell wichtig für Morphogenese und Freisetzung subviraler HBV- und HDV-Partikeltypen. Die COPII-Maschinerie, insbesondere ihre Untereinheiten Sec24A und Sec23B, konnte als zelluläre Schlüsselkomponente bei der Sekretion beider Arten subviraler Partikel identifiziert werden. Hierbei konnte HBV.S eine direkte und ausschließliche Interaktion mit der Isoform Sec24A nachgewiesen werden, die von Sec23B abhängig ist und die die zwei basischen AS 78 und 79 in der zytosolischen Schleife von HBV.S involviert. Eine Blockade der Interaktion zwischen HBV.S und Sec24A alleine führte hierbei zu einer Dislokation des viralen Proteins unter Bildung von Aggregat-ähnlichen Strukturen. Die sekretorische Abhängigkeit von Sec24A zeigte sich auch bei dem Hepatitis-Virus der Ente und suggeriert eine hohe Konservierung dieser Interaktion. Sec24A und Sec23B konnten zudem als notwendig für die Sekretion infektiöser HBV-Virionen identifiziert werden. Diese Resultate bieten wertvolle, neue Möglichkeiten der Invention in den Lebenszyklen beider Viren durch direkte Inhibition der Sec24A-HBV.S-Interaktion.
HBV is one of the most successful pathogens worldwide, partially because there is no curative therapy available. The clinical picture of an HBV infection appears as acute and chronic hepatitis, liver cirrhosis and hepatocellular carcinomas. Co-infection with HDV, which is reliant on the HBV envelope proteins, thereby leads to a much more drastic disease process. Since both viruses are characterized by conspicuously small genomes, interactions between the pathogens and cellular host factors are obligatory. Within this work, the focus has been placed on the analysis of intracellular transport mechanisms for possible functions in the pathogenesis of both viruses. For this purpose, subviral HDV particles were generated and characterized by immunoprecipitation and immunofluorescence for their morphological and secretory dependence on HBV.S. Three transport machineries, ESCRT, Clathrin- and COPII-mediated vesicle transport, were investigated for their functions in the life cycle of HBV and HDV by siRNA interference and inhibition by chemicals or by using dominant negative mutants with immunofluorescence, immunoprecipitation and subcellular fractionation techniques. ESCRT does not appear to be needed for the secretion of HDV SVPs and only tends to affect the morphogenesis of these particles. Clathrin was found to be functionally important in morphogenesis and release of subviral HBV and HDV particle types. The COPII machinery, in particular its subunits Sec24A and Sec23B, could be identified as a key cellular component in the secretion of both types of subviral particles. HBV.S showed direct and exclusive interaction with the isoform Sec24A, which is dependent on Sec23B and which involves the two basic AA 78 and 79 in the cytosolic loop of HBV.S. Blocking the interaction between HBV.S and Sec24A alone resulted in dislocation of the viral protein among formation of aggregate-like structures. The secretory dependence of Sec24A was also demonstrated on subviral particles of the duck hepatitis B virus, suggesting a high conservation of this interaction. In addition, Sec24A and Sec23B were identified as necessary for the secretion of infectious HBV virions. These results provide valuable, new possibilities of invention in the lifecycles of both viruses by direct inhibition of the Sec24A-HBV.S interaction.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 04 Medizin
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-1647
URN: urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000035498
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: XI, 148 Blätter
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