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Authors: Schütte, Andre
Title: Gen knockdown der Metalloproteasen Meprin alpha 1, alpha 2 und beta im Zebrabärbling Danio rerio
Online publication date: 22-Jan-2010
Language: german
Abstract: Die Metalloproteasen Meprin α und β übernehmen Schlüsselfunktionen in vielen (patho-) physiologischenrnProzessen. So sind sie beteiligt an der Umstrukturierung der extrazellulären Matrix, an immunologischenrnReaktionen oder an entzündlichen Gewebserkrankungen. Die beiden Enzyme kommenrnhauptsächlich in den Bürstensaummembranen von Niere und Darm sowie in der Haut von Vertebratenrnvor. Für die Erforschung der biologischen Aktivität der Meprine wurde in dieser Arbeit der ModellorganismusrnDanio rerio verwendet, der vor allem durch die Möglichkeit der gentechnischen Manipulationrnprädestiniert ist. Im Fisch konnten drei homologe Enzyme (Meprin α1, α2 und β) nachgewiesenrnwerden. Während mRNA-Analysen eine nahezu ubiquitäre Verteilung der Meprine offenbarten,rnkonnte ich mittels spezifischer Antikörper die Expression auf Proteinebene nachweisen. WährendrnMeprin α1 und β verstärkt im Darmepithel und in der Epidermis lokalisiert sind, konnte Meprinrnα2 ausschließlich in der Lamina propria des Darms identifiziert werden.rnDer Hauptteil der vorliegenden Arbeit zielt auf die spezifische Reduzierung des Expressionslevels derrnMeprine in Embryonen des Zebrabärblings. Dies wurde durch die Mikroinjektion von sogenanntenrnMorpholinos in die Zygote erzielt. Morpholinos sind RNA-Moleküle, die spezifisch an die mRNA desrnZielproteins binden können und die Translation verhindern. Die auftretenden Effekte durch das Fehlenrnder Meprine lassen so Rückschlüsse auf ihre physiologische Funktion zu. Nach der Injektion vonrnMorpholinos gegen Meprin α1 zeigten sich lediglich leichte epidermale Deformationen. Bei Meprin βrnhingegen kam es zu einer massiven Fehlbildung von Organen im Rumpf- und Schwanzbereich. Diesesrnführte zu erheblichen Defekten; die Embryonen starben innerhalb der ersten 24 Stunden nach derrnBefruchtung. Demzufolge müssen Meprin α1 und Meprin β insbesondere an der Gewebsdifferenzierungrnbeteiligt sein. Dies korreliert mit verschiedenen Experimenten, u.a. an knockout Mäusen, ausrndenen hervorgeht, dass die Prozessierung und Aktivierung der Cytokine Interleukin-1β oder Interleukin-rn18 durch Meprin β erfolgen kann.rnDie Injektion von Meprin α2-Morpholinos erbrachte ein weiteres, eindrucksvolles Ergebnis: Das Blutgefäßsystemrnvon injizierten Embryonen war vollständig unterbrochen und es sammelten sich Erythrozytenrnim Bereich der Caudalvene an. Diese Phänotypen gleichen den knockdown-Experimenten mitrndem vascular endothelial growth factor VEGF-A, dem entscheidenden Wachstumsfaktor in der Angiogenesern(Blutgefäßbildung). Eine Inkubation des humanen VEGF-A mit (humanem) rekombinantemrnMeprin α bzw. β führte zu einer differenzierten Prozessierung des Moleküls. Diese Ergebnisse legenrnnahe, dass Meprin α pro-angiogenetisch wirkt, indem es VEGF-A prozessiert und damit die Gefäßbildungrnaktiviert. Aus den Daten dieser Arbeit wird die hohe Signifikanz der Meprine für die Proliferationrnund Differenzierung spezieller Gewebe deutlich, welche somit eine wichtige Grundlage für Studienrnan höheren Vertebraten darstellt.
The metalloproteases meprin α and β play key roles in several (patho-)physiological processes, e.g. cell differentiation, proliferation and inflammation Both enzymes are mainly expressed in the brush border membranes of kidney and intestine, and in skin of vertebrates. To investigate the biological activity of meprins, the model organism Danio rerio, which is appropriate for genetic manipulation in particular, was used in this work. Hence, three homologous meprin enzymes (meprin α1, α2 and β) have been identified in the zebrafish Danio rerio. Analysis on mRNA level revealed a nearly ubiquitious expression of these proteases, confirmed on protein level with specific antibodies. While meprin α1 and β are predominantly expressed in the epithelia of the intestine and in the epidermis, meprin α2 was exclusively identified in the lamina propria of the intestine.rnThe main target of this work was to reduce the expression level of meprin metalloproteases in zebrafish embryos. This was achieved by the microinjection of so called morpholinos into the zygote. Morpholinos are chemically altered molecules similar to RNA, which can bind to the mRNA specifically, thereby inhibiting the translational processes. Occurring effects due to the reduced expression of meprins provided evidence for physiological functions. After the injection of morpholinos targeted against meprin α1, only slight epidermal deformations were observed in the developing embryos. In contrast, meprin β morphants showed massive dysplasia in the trunk and tail region. This led to serious defects; the embryos died within the first 24 hours post fertilization (hpf). Accordingly, meprin α1 and β are thought to be involved in tissue differentiation. This correlates with experiments made in knockout mice, which show the processing and activation of cytokines, e.g. interleukin-1β or interleukin-18 through meprin β.rnThe injection of meprin α2-morpholinos resulted in a striking phenotype: the blood vessel system of injected embryos was largely disturbed, and erythrocytes accumulated in the region of the caudal vein. These phenotypes mimic specifically the knockdown-phenotypes of the vascular endothelial growth factor VEGF-A, which is the major cytokine in angiogenesis. The incubation of human VEGF-A with human recombinant meprin α and β, respectively, led to a distinct processing of the cytokine. These results suggest, that meprin α2 promotes angiogenesis by the processing of VEGF-A and, thereby, enhances the formation of blood vessels. This work demonstrates the significance of the meprins for proliferation and differentiation of specific tissues and therefore provides a basis for studies of these metalloproteases in higher vertebrates. rn
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-1624
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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