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Authors: Scheu, Patrick Daniel
Title: Oligomerisation, localisation and interaction of the sensor histidine kinases DcuS and CitA in Escherichia coli
Online publication date: 21-Dec-2009
Language: english
Abstract: The two-component system DcuSR of Escherichia coli regulates gene expression of anaerobic fumarate respiration and aerobic C4-dicarboxylate uptake. C4-dicarboxylates and citrate are perceived by the periplasmic domain of the membrane-integral sensor histidine kinase DcuS. The signal is transduced across the membrane by phosphorylation of DcuS and of the response regulator DcuR, resulting in activation of DcuR and transcription of the target genes.\r\nIn this work, the oligomerisation of full-length DcuS was studied in vivo and in vitro. DcuS was genetically fused to derivatives of the green fluorescent protein (GFP), enabling fluorescence resonance energy transfer (FRET) measurements to detect protein-protein interactions in vivo. FRET measurements were also performed with purified His6-DcuS after labelling with fluorescent dyes and reconstitution into liposomes to study oligomerisation of DcuS in vitro. In vitro and in vivo fluorescence resonance energy transfer showed the presence of oligomeric DcuS in the membrane, which was independent of the presence of effector. Chemical crosslinking experiments allowed clear-cut evaluation of the oligomeric state of DcuS. The results showed that detergent-solubilised His6-DcuS was mainly monomeric and demonstrated the presence of tetrameric DcuS in proteoliposomes and in bacterial membranes.\r\nThe sensor histidine kinase CitA is part of the two-component system CitAB of E. coli, which is structurally related to DcuSR. CitAB regulates gene expression of citrate fermentation in response to external citrate. The sensor kinases DcuS and CitA were fused with an enhanced variant of the yellow fluorescent protein (YFP) and expressed in E. coli under the control of an arabinose-inducible promoter. The subcellular localisation of DcuS-YFP and CitA-YFP within the cell membrane was studied by means of confocal laser fluorescence microscopy. Both fusion proteins were found to accumulate at the cell poles. The polar accumulation was slightly increased in the presence of the stimulus fumarate or citrate, respectively, but independent of the expression level of the fusion proteins. Cell fractionation demonstrated that polar accumulation was not related to inclusion bodies formation. The degree of polar localisation of DcuS-YFP was similar to that of the well- characterised methyl-accepting chemotaxis proteins (MCPs), but independent of their presence. To enable further investigations on the function of the polar localisation of DcuS under physiological conditions, the sensor kinase was genetically fused to the flavin-based fluorescent protein Bs2 which shows fluorescence under aerobic and anaerobic conditions. The resulting dcuS-bs2 gene fusion was inserted into the chromosome of various E. coli strains.\r\nFurthermore, a protein-protein interaction between the related sensor histidine kinases DcuS and CitA, regulating common metabolic pathways, was detected via expression studies under anaerobic conditions in the presence of citrate and by in vivo FRET measurements.
Das Zweikomponentensystem DcuSR von Escherichia coli reguliert die Expression der Gene der anaeroben Fumaratatmung und der aeroben C4-Dicarboxylat-Aufnahme. C4-Dicarboxylate und Citrat werden über die periplasmatische Domäne der membranständigen Sensorhistidinkinase DcuS erkannt. Das Signal wird durch Phosphorylierung der Sensorkinase und des Response-Regulators DcuR über die Membran geleitet und führt zur Aktivierung der Zielgene.\r\nIn dieser Arbeit wurde die Oligomerisierung von intaktem DcuS in vivo und in vitro untersucht. Es wurden Proteinfusionen von DcuS mit Varianten des Grün-fluoreszierenden Proteins (GFP) für Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET)-Messungen hergestellt, um Proteinwechselwirkungen in der Zelle zu untersuchen. Des Weiteren wurden FRET-Messungen mit gereinigtem His6-DcuS nach Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen und Rekonstitution in Liposomen durchgeführt. Sowohl in vitro als auch in vivo zeigte sich Fluoreszenzresonanz-Energietransfer und somit ein oligomerer Funktionszustand von DcuS in der Membran, der ligandenunabhängig war. Chemisches Crosslinking mit Disuccinimidyl-suberat (DSS) zeigte, dass Detergenz-solubilisiertes His6-DcuS hauptsächlich als Monomer vorliegt, in der Bakterienmembran und in Proteoliposomen eingebautes His6-DcuS dagegen als Tetramer.\r\nDie Sensorhistidinkinase CitA ist Teil des Zweikomponentensystems CitAB von E. coli, welches strukturell mit DcuSR verwandt ist. CitAB reguliert die Expression der Gene der Citratfermentation in Anwesenheit von extrazellulärem Citrat. Die Sensorkinasen DcuS und CitA wurden mit einer Fluoreszenz-verstärkten Variante des Gelb-fluoreszierenden Proteins (YFP) fusioniert und in E. coli unter der Kontrolle eines Arabinose-induzierbaren Promotors exprimiert. Die subzelluläre Lokalisation von DcuS-YFP und CitA-YFP innerhalb der Cytoplasmamembran wurde mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Beide Fusionsproteine zeigten eine Anreicherung an den Zellpolen. Die polare Anreicherung wurde durch die Anwesenheit des entsprechenden Effektors, Fumarat oder Citrat, leicht erhöht und war unabhängig von der Expressionsstärke des Fusionsproteins. Zellfraktionierung zeigte, dass die polare Anreicherung nicht durch Bildung von Einschlusskörpern verursacht wurde. Die polare Anreicherung von DcuS-YFP war ähnlich der der gut untersuchten methylakzeptierenden Chemotaxisproteine (MCPs), jedoch unabhängig von diesen. Für weiterführende Studien zur Funktion der polaren Lokalisation von DcuS unter physiologischen Bedingungen wurde die Sensorkinase mit dem Flavin-haltigen Fluoreszenzprotein Bs2 fusioniert, welches im Aeroben und im Anaeroben fluoresziert. Die dcuS-bs2 Genfusion wurde in das Chromosom verschiedener E. coli-Stämme integriert.\r\nDes Weiteren wurde eine Proteinwechselwirkung zwischen den verwandten Sensorhistidinkinasen DcuS und CitA, welche zusammenhängende Stoffwechselwege regulieren, durch Expressionsanalysen mit Citrat und durch in vivo FRET-Messungen gezeigt.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-1614
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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