Authors:	Awe, Karin
Title:	Charakterisierung zellulärer Interaktionspartner des großen Hüllproteins des Hepatitis-B-Virus
Online publication date:	21-Oct-2009
Year of first publication:	2009
Language:	german
Abstract:	Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand das große L-Hüllprotein (L) des Hepatitis B - Virus. L bildet eine ungewöhnliche duale Topologie in der ER-Membran aus, welche auch im reifen Viruspartikel erhalten bleibt. In einem partiellen, posttranslationalen Reifungsprozess wird die sogenannte PräS-Region von der zytosolischen Seite der Membran aus in das ER-Lumen transloziert. Aufgrund seiner dualen Topologie und der damit verbundenen Multifunktionalität übernimmt L eine Schlüsselfunktion im viralen Lebenszyklus. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit lag deshalb darin, neue zelluläre Interaktionspartner des L-Hüllproteins zu identifizieren. Ihre Analyse sollte helfen, das Zusammenspiel des Virus mit der Wirtszelle besser zu verstehen. Hierfür wurde das Split - Ubiquitin Hefe - Zwei - Hybrid System eingesetzt, das die Interaktionsanalyse von Membranproteinen und Membran-assoziierten Proteinen ermöglicht. Zwei der neu identifizierten Interaktionspartner, der v-SNARE Bet1 und Sec24A, die Cargo-bindende Untereinheit des CoPII-vermittelten vesikulären Transports, wurden weitergehend im humanen Zellkultursystem untersucht. Sowohl für Bet1 als auch für Sec24A konnte die Interaktion mit dem L-Hüllprotein bestätigt und der Bindungsbereich eingegrenzt werden. Die Depletion des endogenen Bet1 reduzierte die Freisetzung L-haltiger, nicht aber S-haltiger subviraler Partikel (SVP) deutlich. Im Gegensatz zu Bet1 interagierte Sec24A auch mit dem mittleren M- und kleinen S-Hüllprotein von HBV. Die Inhibition des CoPII-vermittelten vesikulären Transportweges durch kombinierte Depletion der vier Sec24 Isoformen blockierte die Freisetzung sowohl L- als auch S-haltiger SVP. Dies bedeutet, dass die HBV - Hüllproteine das ER CoPII-vermittelt verlassen, wobei sie aktiv Kontakt zur Cargo-bindenden Untereinheit Sec24A aufnehmen. Der effiziente Export der Hüllproteine aus dem ER ist für die Virusmorphogenese und somit für den HBV - Lebenszyklus essentiell. \r\nEin weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit basierte auf der Interaktion des L-Hüllproteins mit dem ER-luminalen Chaperon BiP. In der vorliegenden Arbeit wurde überprüft, ob BiP, ähnlich wie das zytosolische Chaperon Hsc70, an der Ausbildung der dualen Topologie des L-Hüllproteins beteiligt ist. Hierfür wurde BiP durch die ektopische Expression seiner Ko-Chaperone BAP und ERdj4 in seiner Substrat-bindenen Kapazität manipuliert. ERdj4, ein Mitglied der Hsp40 - Proteinfamilie, stimuliert die ATPase-Aktivität von BiP, was die Substratbindung stabilisiert. Der Nukleotid - Austauschfaktor BAP hingegen vermittelt die Auflösung des BiP - Substrat - Komplexes. Die Auswirkung der veränderten in vivo-Aktivität von BiP auf die posttranslationale PräS-Translokation wurde mit Proteaseschutz - Versuchen untersucht. Die ektopische Expression des positiven als auch des negativen Regulators von BiP resultierte in einer drastischen Reduktion der posttranslationalen PräS-Translokation. Ein vergleichbarer Effekt wurde nach Manipulation des BiP ATPase - Zyklus durch Depletion der zellulären ATP - Konzentration beobachtet. Dies spricht dafür, dass das ER-luminale Chaperon BiP, zusammen mit Hsc70, eine zentrale Rolle in der Ausbildung der dualen Topologie des L-Hüllproteins spielt. \r\nZwei weitere Proteine, Sec62 und Sec63, die sich für die posttranslationale Translokation in der Hefe als essentiell erwiesen haben, wurden in die Analyse der dualen Topologie des L-Hüllproteins einbezogen. Interessanterweise konnte eine rein luminale Ausrichtung der PräS-Region nach kombinierter Depletion des endogenen Sec62 und Sec63 beobachtet werden. Dies deutet an, dass sowohl Sec62 als auch Sec63 an der Ausbildung der dualen Topologie des L-Hüllproteins beteiligt sind. In Analogie zur Posttranslokation der Hefe könnte Sec62 als Translokon-assoziierter Rezeptor für Substrate der Posttranslokation, und damit der PräS-Region, dienen. Sec63 könnte mit seiner J-Domäne BiP zum Translokon rekrutieren und daraufhin dessen Substrat-bindende Aktivität stimulieren. BiP würde dann, einer molekularen Ratsche gleich, die PräS-Region durch wiederholtes Binden und Freisetzen aktiv in das ER-Lumen hereinziehen, bis eine stabile duale Topologie des L-Hüllproteins ausgebildet ist. Die Bedeutung von Sec62 und Sec63 für den HBV - Lebenszyklus wird dadurch untermauert, dass sowohl die ektopische Expression als auch die Depletion des endogenen Sec63 die Freisetzung L-haltiger SVP deutlich reduziert. \r\n The focus of interest of this thesis was the large L envelope protein of the hepatitis B virus. L forms an unusual dual topology at the endoplasmic reticulum (ER) membrane which is preserved in the mature virus particle. In a partial posttranslational maturation process the so-called preS-region is translocated from the cytosolic side of the membrane into the ER lumen. Due to its dual topology and the resulting multifunctionality L has a key role in the viral life cycle. Therefore, one priority of this thesis was to identify new cellular interaction partners of the L envelope protein. Their investigation should help to better understand the interplay between the virus and its host cell. For this purpose, the split-ubiquitin yeast two-hybrid system which allows the analysis of protein-protein interactions between membrane proteins and membrane-associated proteins was used. Two of the newly identified interaction partners, the v-SNARE Bet1 and Sec24A, the cargo-binding subunit of the COPII-dependent vesicular transport, were further investigated using human cell culture techniques. For both, Bet1 and Sec24A, the interaction with the L envelope protein could be confirmed and the binding site could be narrowed down. Depletion of endogenous Bet1 reduced the release of L- but not S-containing subviral particles (SVP). In contrast to Bet1, Sec24A also interacted with the HBV middle and small envelope protein. The inhibition of the COPII-dependent vesicular transport by combined depletion of the four Sec24 isoforms blocked the release of L- as well as S-containing SVP. This implicates that the HBV envelope proteins exit the ER mediated by the COPII-dependent transport machinery making contact to the cargo-binding subunit Sec24A. The efficient ER-export of the envelope proteins is essential for viral morphogenesis and therefore the HBV life cycle. \r\nThe second point of interest of this thesis was based on the interaction of the L envelope protein with the ER luminal chaperone BiP. The central question was whether BiP, similar to the cytosolic chaperone Hsc70, is involved in the formation of the dual topology of the L envelope protein. For this purpose, BiP was manipulated in its substrate binding capacity by overexpressing its co-chaperones BAP and ERdj4. ERdj4, a member of the Hsp40 protein family, stimulates the ATPase activity of BiP thereby stabilizing substrate binding. In contrast, the nucleotide exchange factor BAP mediates the dissociation of the BiP substrate complex. Protease protection assays were performed to measure the effect of the manipulated in vivo activity of BiP on posttranslational preS-translocation. The ectopic expression of either the positive or the negative regulator of BiP resulted in a reduction of posttranslational preS-translocation. A similar effect was observed after manipulation of the BiP ATPase cycle by depletion of the cellular ATP concentration. This implicates that the ER luminal chaperone BiP, in conjunction with Hsc70, plays a central role in the formation of the dual topology of the L envelope protein. \r\nTwo further proteins, Sec62 and Sec63, which have been shown to be essential for posttranslational protein translocation in yeast, were included in the analysis of the dual topology of the L envelope protein. Interestingly, after combined depletion of endogenous Sec62 and Sec63 an entire luminal orientation of the preS-region could be observed. This suggests that both Sec62 as well as Sec63 are involved in the formation of the dual topology of the L envelope protein. In analogy to posttranslational protein translocation in yeast Sec62 could serve as a translocon-associated receptor for substrates destined for posttranslocation and hence the preS-region. Mediated by its J-domain Sec63 could recruit BiP to the translocon and stimulate its substrate-binding activity. BiP, acting as a molecular ratchet, would then pull the preS-region through repeated binding and release into the ER lumen until a stable dual topology is established. The importance of Sec62 and Sec63 for the HBV life cycle was confirmed through the observation that both the ectopic expression and the depletion of endogenous Sec63 reduced the release of L-containing SVP drastically.\r\n
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1573
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-21086
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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