Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-1564
Authors: Herz, Stephanie
Title: Optimization of RNA-based transgene expression by targeting Protein Kinase R
Online publication date: 13-May-2015
Language: english
Abstract: The aim of this thesis was to establish a method for repeated transfection of in vitro transcribed RNA (IVT-RNA) leading to a sustained protein expression lasting for days or even weeks. Once transfected cells recognize IVT-RNA as "non-self" and initiate defense pathways leading to an upregulated interferon (IFN) response and stalled translation. In this work Protein Kinase R (PKR) was identified as the main effector molecule mediating this cellular response. We assessed four strategies to inhibit PKR and the IFN response: A small molecule PKR inhibitor enhanced protein expression and hampered the induction of IFN-transcripts, but had to be excluded due to cytotoxicity. A siRNA mediated PKR knockdown and the overexpression of a kinase inactive PKR mutant elevated the protein expression, but the down-regulation of the IFN response was insufficient. The co-transfer of the viral inhibitors of PKR and the IFN response was most successful. The use of E3, K3 and B18R co-transfection enabled repeated IVT-RNA-based transfection of human fibroblasts. Thus, the developed protocol allows a continuous IVT-RNA encoded protein expression of proteins, which could be the basis for the generation of induced pluripotent stem cells (iPS) for several therapeutic applications in regenerative medicine or drug research.
Das Ziel dieser Arbeit bestand in der Etablierung einer Methode, welche eine wiederholte Transfektion mit in vitro transkribierter RNA (IVT-RNA) ermöglicht und zu einer mehrtägigen Proteinexpression beiträgt. Nach einer Transfektion erkennen die Zellen IVT-RNA als "nicht-selbst" und induzieren zelluläre Abwehrmechanismen, welche durch die Interferonantwort (IFN) vermittelt und von einer Herunterregulation der Translation begleitet sind. Die Protein Kinase R (PKR) besitzt eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion, weshalb mittels vier Strategien eine Inhibition der PKR sowie der IFN Antwort verfolgt wurde. Ein niedermolekularer PKR Inhibitor steigerte die Proteinexpression und reduzierte die Interferonantwort, musste aber wegen Zytotoxizität ausgeschlossen werden. Sowohl durch siRNA vermittelte Herunterregulation der PKR, als auch durch die Überexpression einer Kinase inaktiven PKR Mutante konnte die Proteinexpression verbessert werden. Die Interferonantwort konnte jedoch nicht ausreichend reduziert werden. Der Co-Transfer von viralen Inhibitoren von PKR und Interferonantwort war am erfolgreichsten. Die Co-Transfektion von E3, K3 und B18R erlaubte repetitive IVT-RNA-basierte Transfektionen von humanen Fibroblasten. Somit kann das entwickelte Protokoll zur kontiuierlichen Expression von IVT-RNA kodierter Proteine verwendet werden, welches z.B. als Grundlage für die Herstellung von induzierten pluripotenten Zellen (iPS) dienen kann. Aber auch therapeutische Anwendungen, die regenerative Medizin sowie die Wirkstoffforschung könnten von diesem Protokoll profitieren.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-1564
URN: urn:nbn:de:hebis:77-39940
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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