Authors:	Kelsch, Annette
Title:	Synthese und Charakterisierung von HPMA-stabilisierten Kolloiden sowie deren Evaluierung in vitro und in vivo
Online publication date:	5-Mar-2015
Year of first publication:	2015
Language:	german
Abstract:	Nanodimensionale Wirkstoff-Trägersysteme sind in der Lage, sowohl die Bioverfügbarkeit als auch das pharmakokinetische Profil von Wirkstoffen drastisch zu verbessern. Hauptgründe dafür sind eine erhöhte Plasma-Halbwertszeit durch die größenbedingte verminderte renale Ausscheidung und eine gesteigerte Anreicherung im Tumorgewebe durch den EPR-Effekt. Diese Arbeit beschreibt die Synthese und Entwicklung neuer kolloidaler Wirkstoff-Trägersysteme, welche biokompatibel, teilweise bioabbaubar und funktionalisierbar sind. Ein Fluoreszenzfarbstoff wurde als hydrophobes Wirkstoffmodell eingekapselt. Wohldefinierte, eng verteilte und funktionalisierbare HPMA-basierte Block- und statistische Copolymere unterschiedlicher Molekulargewichte (10-25 kDa) und hydrophiler/hydrophober Zusammensetzung (10-50 mol%) wurden mittels RAFT- Polymerisation in Kombination mit dem Reaktivesteransatz hergestellt und in Miniemulsionsprozesse eingesetzt, um ihre Stabilisierungseffizienz zu untersuchen. Dabei zeigte sich, dass die kleineren Copolymere (10 kDa) mit einem Einbau von 10 mol% LMA, sowohl im Modellsystem Polystyrol, als auch im bioabbaubaren PDLLA-System, besonders geeignet sind und ergaben monodisperse Kolloide im Größenbereich von 100 bis 300 nm. Die kolloidalen Systeme zeigten keine Wirkung auf die Zellviabilität. In Folge dessen wurde das Aggregationsverhalten in humanem Blutserum mittels DLS untersucht, wobei keine Interaktion mit Blutbestandteilen festgestellt werden konnte. Zellaufnahmestudien wurden an HeLa-Zellen durchgeführt, um das Schicksal der Kolloide in vitro zu untersuchen. Dabei wurden Kernmaterial, Hülle und das hydrophobe Wirkstoffmodell durch unterschiedliche Fluoreszenzmarkierung getrennt betrachtet. Das hydrophobe Wirkstoffmodell wurde allein durch Interaktion der Kolloide mit den Zellen übertragen, was für eine diffusionsbedingte, initiale, aber unspezifische Freisetzung spricht. Eine solche Freisetzungskinetik kann durch Verwendung von Nitroglycerin, als vasodilatierender Wirkstoff mit geringer unspezifischer Wirkung, ausgenutzt werden, um den EPR-Effekt zu unterstützen. Die Aufnahme des Partikels hingegen geschieht zeitverzögert. Das Schicksal der Kolloide (sowohl des Kern- und desrnHüllmaterials) wurde durch doppelte Fluoreszenzmarkierung untersucht. Dabei kam es zu einer intrazellulären Ablösung der stabilisierenden Block-Copolymere zwischen 8 und 24 h. Nach Aufklärung der Aufnahme- und Freisetzungskinetiken wurde nun die Körperverteilung der PS- und PDLLA-Kolloide nach 18F-Markierung mittels PET und ex vivo-Biodistributiosstudien untersucht. Dabei hatte das Kernmaterial einen Einfluss auf die Körperverteilung. PET-Studien in Mäusen zeigten, dass die stabilisierenden Block-Copolymere beider Kolloide ein starkes Signal in der Niere geben, wobei das der PS-Kolloide weiter ausgeprägt war. Darüber hinaus war eine Anreicherung dieser in Lunge, Leber und Milz festzustellen. Die Verdrängung der stabilisierenden Polymere durch die Interaktion mit Blutbestandteilen erklärt dabei das erhöhte Nieren- und Blasensignal der PS- Kolloide. Das Anreicherungsmuster der PDLLA-Kolloide hingegen zeigte neben der Nierenakkumulation eine erhöhte Blutaktivität und somit die gewünschten langzirkulierenden Eigenschaften. Diese Ergebnisse konnten auch mittels ex vivo- Biodistributionsstudien bestätigt werden. Um die Tumoranreicherung weiter zu verbessern wurde die Verwendung von Folat als Erkennungsstruktur am einfachen HPMA-Polymer untersucht. Die Konjugate zeigten eine erhöhte Anreicherung im Vergleich zu den Polymeren ohne Erkennungsstrukturen. Blockadestudien bestätigten die Selektivität der Anreicherung. Diese Daten zeigen das Potential der Folat-Erkennungsstruktur in vivo innerhalb kurzer Zeitfenster, welche nun auf kolloidale Systeme übertragen werden kann. Nanodimensional drug carrier systems are of enormous interest in cancer therapy by improving bioavailability and the pharmacokinetic profile of (chemo-) therapeutics. The main reason is an increased plasma half-life as consequence of size-dependent decreased renal excretion as well as an increased accumulation in the tumor tissue due to passive targeting (EPR effect).rnColloids prepared in this work have a defined shape, consisting of a biocompatible/biodegradable polymer core stabilized by polymeric surfactants. This allows the encapsulation of hydrophobic drugs (e.g. fluorescent dyes as hydrophobic drug model) and the attachment of targeting vectors by using HPMA-based surfactants. Therefore, HPMA-based block and random copolymers with different sizes and hydrophobic segment ratios were synthesized via RAFT polymerization in combination with the activated ester approach. Subsequently, these copolymers were used as surfactants in miniemulsion processes and screened in respect to their stabilization efficacy. The copolymers with sizes of 10 kDa and a hydrophobic LMA- incorporation of around 10 mol% were most qualified for stabilizing polystyrene and poly-D/L-lactide colloids leading to sizes of around 100-300 nm in diameter. To investigate the biological applicability, toxicity assays (MTS assays) were conducted showing no cytotoxicity up to concentrations of 1.2 mg/mL. Furthermore, DLS experiments were carried out in human blood serum to investigate interactions with blood components showing no interactions. The colloids themselves have also been labeled with fluorescent dyes for cell uptake and release kinetics of the hydrophobic drug model. To visualize all colloid components independently, core and shell materials, as well as the hydrophobic drug model were fluorescent by attaching different dyes. It could be shown, that the drug model is taken up into the cells first, followed by a delayed uptake of the colloids. Such an initial burst release is e.g. suitable for delivery of nitroglycerin having no off-target effect and leading to vasodilatation of blood vessels followed by an enhancement of the EPR effect. Inside the cells a slow detachment of the stabilizing block copolymers has been observedrnbetween 8 h to 24 h, which allows a controlled release of a second covalently bound drug. To investigate the pharmacokinetic profile of the colloids ?PET studies and ex vivo biodistributions have been performed showing a strong signal in kidneys and bladder, which was much more pronounced in the case of polystyrene compared to polylactide colloids. The detachment of the 18F-labeled block copolymers as a consequence of aggregation with blood components is one possible explanation for the strong kidney and bladder signals. Besides, different accumulation patterns of both systems were observed showing a strong dependency on the core material. Polystyrene colloids predominantly accumulated in liver and spleen, whereas polylactide colloids showed high blood activity levels. These results indicate and underline that PDLLA-based colloids are promising candidates for long circulating drug delivery systems. To investigate the folate-targeting concept HPMA-based folate conjugates were synthesized and tested in tumor bearing rats. These studies showed an increased tumor uptake in the case of folate-targeted polymers compared to non-targeted polymers underlining the huge potential of the folate- targeting concept in vivo within short time frames and their potential also for colloidal systems.
DDC:	540 Chemie 540 Chemistry and allied sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1561
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-39908
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Appears in collections:	JGU-Publikationen