Authors:	Holloway, Steven
Title:	Synthese, Charakterisierung und Testung von Phenylacrylsäure-Derivaten, Benzothiazolen und Diarylthioethern als potentielle Inhibitoren der Dengue-Virus-Typ-2-NS2B-NS3-Protease
Online publication date:	15-Jan-2015
Year of first publication:	2015
Language:	german
Abstract:	Dengue-Fieber ist eine durch Stechmücken der Gattungen Aedes aegypti und Aedes albopticus übertragene, virale Infektionskrankheit des Menschen, welche eine zunehmende Bedrohung für die Weltbevölkerung darstellt; das Infektionsrisiko betrifft vorwiegend Menschen, die in tropischen und subtropischen Gebieten der Erde (Asien, Afrika, Amerika) leben. Bei dem Erreger handelt es sich um ein Flavivirus, bestehend aus einer positiv polarisierten Einzelstrang-RNA, welches in vier verschiedenen Serotypen existiert. Eine Infektion mit Dengue-Viren zeigt sich durch drei mögliche Krankheitsbilder: Klassisches Dengue-Fieber (DF), hämorrhagisches Dengue-Fieber (DHF) oder Dengue-Schock-Syndrom (DSS). Das Dengue-Virus-Genom codiert eine Serin-Protease mit einer klassischen katalytischen Triade, bestehend aus den Aminosäuren His51, Asp75 und Ser135. Die Funktion der Dengue-Virus-Protease besteht in der post-translationalen, proteolytischen Prozessierung des viralen Polyprotein-Vorläufers, womit sie essentiell für die Virus-Replikation ist und damit einen wichtigen therapeutischen Ansatz für die Entwicklung neuer Wirkstoffe gegen Dengue-Fieber darstellt. Die Ziele der vorliegenden Arbeit bestanden darin, neue potentielle Inhibitoren der Dengue-Virus Typ 2 NS2B-NS3 Protease (DEN-2 NS2B-NS3pro) zu synthetisieren, deren Hemmwirkung sowie den Inhibitionstyp mithilfe fluorimetrischer Enzym-Assays zu bestimmen, Struktur-Wirkungs-Beziehungen (u.a. mithilfe von Molecular Docking-Rechnungen) zu analysieren und die erhaltenen Leitstrukturen zu optimieren. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Substanzklassen und damit zwei Teilprojekte behandelt: Phenylacrylsäureamide im ersten Teilprojekt, Benzothiazole und Diarylthioether zusammen im zweiten Teilprojekt. Im ersten Teilprojekt zeigten einige Phenylacrylsäureamide eine schwache Hemmung der DEN-2 NS2B-NS3pro zwischen ca. 50 und 61 % bei einer Inhibitorkonzentration von 50 µM sowie eine nicht-kompetitive Hemmung, welche jedoch durch vielfältige Derivatisierung kaum verändert oder verbessert werden konnte. Darüber hinaus wurden die endogenen Serin-Proteasen alpha-Chymotrypsin und Trypsin durch einige Phenylacrylsäureamide erheblich stärker gehemmt als die DEN-2 NS2B-NS3pro. Das zweite Teilprojekt befasste sich mit der Synthese und Testung von Diarylthioethern mit hydroxy-substituierten Benzothiazol-Bausteinen sowie der Testung einiger methoxy-substituierter Synthese-Vorstufen der Endverbindungen, um die Relevanz und den Einfluss der einzelnen Bausteine auf die Hemmung der DEN-2 NS2B-NS3pro zu untersuchen. Der in der vorliegenden Arbeit synthetisierte, potenteste Inhibitor der DEN-2 NS2B-NS3pro (Hemmung: 90 % [50 µM]; IC50 = 3.6 +/- 0.11 µM) und der DEN-3 NS2B-NS3pro (Hemmung: >99 % [100 µM]; IC50 = 9.1 +/- 1.02 µM), SH65, ein Diarylthioether-Benzothiazol-Derivat, entstand aufgrund der Vorhersage zweier möglicher Bindungsmodi (kompetitiv und nicht-kompetitiv) mithilfe von Molecular Docking-Experimenten an der Röntgen-Kristall-struktur der DEN-3 NS2B-NS3pro (PDB-Code: 3U1I). Nach experimenteller Bestimmung der IC50-Werte bei unterschiedlichen Substratkonzentrationen erwies sich SH65 jedoch als nicht-kompetitiver Inhibitor der DEN-2 NS2B-NS3pro. Trypsin wurde von SH65 vergleichbar stark gehemmt (96% [50 µM]; IC50 = 6.27 +/- 0.68 µM) wie die beiden getesteten Dengue-Virus-Proteasen, nicht jedoch alpha-Chymotrypsin (nur 21% Hemmung bei 50 µM), wodurch diesem Inhibitor zumindest eine relative Selektivität gegenüber Serin-Proteasen zugeschrieben werden kann. SH65 zeigte lediglich Protease-Hemmung in den Enzym-Assays, jedoch keine antivirale Aktivität bei der Testung an Dengue-Virus-infizierten Zellen, was aber wiederum bei der synthetisierten Vorstufe von SH65, welche anstelle der beiden Hydroxy-Gruppen über Methoxy-Gruppen verfügt, der Fall war. Diarylthioether mit mehrfach hydroxy-substituiertem Benzothiazol-Baustein stellen hiermit eine neue, vielversprechende Wirkstoffgruppe zur Hemmung sowohl der Dengue-Virus Typ 2- als auch der Dengue-Virus Typ 3 NS2B-NS3 Protease dar. Dengue, a mosquito-borne viral infection of humans, transmitted by Aedes aegypti and Aedes albopticus mosquitoes, has become a continuing global threat, since 2.5 billion people living in tropical and subtropical regions of the world (predominantly in Asia, Africa and the Americas) are at risk of infection. The infection is caused by a flavivirus with a single positive-stranded RNA genome and four distinct serotypes. The dengue virus infection can result in classic dengue fever (DF), dengue hemorrhagic fever (DHF) or dengue shock syndrome (DSS). The dengue virus genome encodes a serine protease with a classical catalytic triad (His51, Asp75 and Ser135), which is responsible for the post-translational proteolytic processing of the polyprotein precursor and essential for the viral replication, making it an important and attractive therapeutic target. The aim of the work presented in this thesis was the design of new potential inhibitors of the dengue virus type 2 NS2B-NS3 protease (DEN-2 NS2B-NS3pro). The type of inhibiton mechanism was characterised in fluorometric enyme assays and possible structure-activity-relationships (SAR) were analysed by using molecular docking calculations. The compounds synthesised in this thesis are divided into two major substance classes: phenylacrylic acid amides as first project, benzothiazoles and diaryl thioethers as second project. Some phenylacrylic acid amides of the first project showed weak inhibition of the DEN-2 NS2B-NS3 protease of approximately 50-61 % at an inhibitor concentration of 50 µM. The type of inhibition was non-competitive and almost neither influenced nor improved by the variation of the various moieties of the derivatives. Furthermore, the endogenic serine proteases alpha-chymotrypsin and trypsin were inhibited much stronger by some phenylacrylic acid derivatives than the DEN-2 NS2B-NS3pro. In the second project, diaryl thioethers with hydroxy-substituted benzothiazole moieties were synthesised and screened including some of their synthetic intermediates to analyse the influence of the distinct moieties on the inhibition. The most potent inhibitor of this second project, SH65, was designed by docking into the X-ray crystal structure of the DEN-3 NS2B-NS3 protease (PDB code: 3U1I) under consideration of two possible binding modes (one competitive, one non-competitive). Experimental determination of IC50 values at various substrate concentrations showed that SH65 is a non-competitive inhibitor of the DEN-2 NS2B-NS3 protease. DEN-2 NS2B-NS3 protease (Inhibiton: 90 % [50 µM]; IC50 = 3.6 +/- 0.11 µM), DEN-3 NS2B-NS3 protease (Inhibiton: >99 % [100 µM]; IC50 = 9.1 +/- 1.02 µM) and trypsin (Inhibition: 96 % [50 µM]; IC50 = 6.27 +/- 0.68 µM) were inhibited by SH65 to a comparable extent, whereas alpha-chymotrypsin was hardly affected by this inhibitor (21 % inhibition at 50 µM), awarding SH65 a relative selectivity towards serine proteases. SH65 showed a high inhibitory activity towards both DEN-2 and DEN-3 NS2B-NS3 proteases but no antiviral activity in cells infected with dengue virus. However, antiviral activity was discovered for the synthetic intermediate of SH65 in which the two hydroxyl groups are replaced by two methoxy groups. In summary, diaryl thioethers containing hydroxy-substituted benzothiazol moieties could represent a promising new class of dengue virus protease inhibitors.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1535
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-39600
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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