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Authors: Röder, Sebastian
Title: Lichtsammler hinter Glas : Stabilisierung und Funktionalisierung des pflanzlichen Hauptlichtsammelkomplexes (LHCII) durch biomineralische Einbettung in Nanopartikel
Online publication date: 14-Jan-2015
Language: german
Abstract: Der Haupt-Lichtsammelkomplex des Fotosystems II (LHCII) setzt sich aus einem Proteinanteil und nicht-kovalent gebundenen Pigmenten â 8 Chlorophyll a, 6 Chlorophyll b und 4 Carotinoide - zusammen. Er assembliert in vivo zu einem Trimer, in dem die Monomereinheiten ebenfalls nicht-kovalent miteinander wechselwirken. Die ausgesprochen hohe Farbstoffdichte und die Tatsache, dass der Komplex rekombinant hergestellt werden kann, machen den LHCII zu einem interessanten Kandidaten für technische Anwendungen wie einer Farbstoffsolarzelle. Allerdings muss hierzu seine thermische Stabilität drastisch erhöht werden.rnDer Einschluss von Proteinen/Enzymen in Silikat erhöht deren Stabilität gegenüber Hitze signifikant. LHCII sollte als erster rekombinanter Membranproteinkomplex mittels kovalent verbundener, polykationischen Sequenzen in Silikat eingeschlossen werden. Hierzu wurde der Komplex auf zwei Weisen polykationisch modifiziert: Auf Genebene wurde die Sequenz des R5-Peptids in den N-terminalen Bereich des LHCP-Gens eingeführt und ein Protokoll zur Überexpression, Rekonstitution und Trimerisierung etabliert. Außerdem wurde eine kovalente Modifikation des trimeren LHCII mit dem Arginin-reichen Protamin über heterobifunktionelle Crosslinker entwickelt. Beide resultierenden LHCII-Derivate waren in der Lage, Silikat autogen zu fällen. Die Stabilisierung der so in Silikat präzipitierten Komplexe war jedoch deutlich geringer als bei nicht-modifizierten Komplexen, die durch eine Spermin-induzierte Copräzipitation eingeschlossenen wurden. Dabei zeigte sich, dass für den Anteil der eingebauten Komplexe und das Ausmaß an Stabilisierung die Größe und klare partikuläre Struktur des Silikats entscheidend ist. Kleine Partikel mit einem Durchmesser von etwa 20 nm führten zu einem Einbau von rund 75 % der Komplexe, und mehr als 80 % des Energietransfers innerhalb des Komplexes blieben erhalten, wenn für 24 Stunden bei 50°C inkubiert wurde. Nicht in Silikat eingeschlossene Komplexe verloren bei 50°C ihren Komplex-internen Energietransfer binnen weniger Minuten. Es war dabei unerheblich, ob die Partikelgröße durch die Wahl des Puffers und des entsprechenden pH-Wertes, oder aber durch Variation des Spermin-zu-Kieselsäure-Verhältnisses erreicht wurde. Wurden die polykationisch veränderten Komplexe in solchen Copräzipitationen verwendet, so erhöhte sich der Anteil an eingebauten Komplexen auf über 90 %, jedoch wurde nur bei der R5-modifizierten Variante vergleichbare Ausmaße an Stabilisierung erreicht. Ein noch höherer Anteil an Komplexen wurde in das Silikatpellet eingebaut, wenn LHCII kovalent mit Silanolgruppen modifiziert wurde (95 %); jedoch war das Ausmaß der Stabilisierung wiederum geringer als bei einer Copräzipitation. Die analysierten Fällungssysteme waren außerdem in der Lage, Titandioxid zu fällen, wobei der Komplex in dieses eingebaut wurde. Allerdings muss das Stabilisierungspotential hier noch untersucht werden. Innerhalb eines Silikatpräzipitats aggregierten die Komplexe nicht, zeigten aber einen inter-trimeren Energietransfer, der sehr wahrscheinlich auf einem Förster Resonanz Mechanismus basiert. rnDies und das hohe Maß an Stabilisierung eröffnen neue Möglichkeiten, rekombinanten LHCII in technischen Applikationen als Lichtsammelkomponente zu verwenden.rn
The major light-harvesting chlorophyll a/b complex (LHCII) of the photosynthetic apparatus in green plants consists of a membrane protein and numerous non-covalently bound pigments â 8 chlorophyll a, 6 chlorophyll b and 4 carotinoids. LHCII assembles in vivo to form a trimer with non-covalently linked monomer units. Due to its high pigment density and the self-organization of the recombinant complex, LHCII is potentially interesting as a light-harvesting component in synthetic constructs. However, for such applications its stability needs to be significantly improved. rnIn this work, LHCII was dramatically stabilized by encapsulating it in polymerizing colloidal silica. Polymerizing was induced by the naturally occurring tetraamine spermine, which was mixed with LHCII (coprecipitation). The encapsulated LHCII stayed functional at 50 °C for up to 24 h instead of a few minutes in detergent solution. Both the extent of stabilization and the yield of encapsulation strongly increased with decreasing diameters of the silica particles. This effect was completely independent of the synthetic route: Small particles (20 nm) could be gained by varying buffer and pH-value as well as the N:Si ratio (spermine to silicic acid ratio) with the same high extent of stabilization (more than 80 % remaining energy transfer) and encapsulation (75 %).rnFurthermore LHCII was modified with polycationic protein-sequences. The diatom-derived R5-peptide was added to the N-terminus of LHCP by fusing the gene sequences. Protocols for overexpression, reconstitution and trimerization of the resulting chimeric protein could be established. In an alternative approach, trimeric LHCII was covalently modified with the protein protamine via a heterobifunctional crosslinker. The silica encapsulation efficiency was enhanced by polycationic peptides attached to LHCII in both cases if modified LHCII was used in a spermine mediated coprecipitation (>90 %). But stabilization differed significantly. While R5-modified LHCII were stabilized comparable to non-modified ones, protamine-modification unexpectedly decreased the extent of stabilization. Both polycationic modified LHCII variants were able to polymerize silicic acid without spermine and thus to promote a self-encapsulation into silica. The extent of stabilization was much lower in comparison to encapsulation via coprecipitation. In neither case, formation of clearly defined particles was observed which seems to be the key-factor for a high extent of stabilization. Encapsulation was nearly quantitative (95 %) when mercaptopropylsilane was introduced to trimeric LHCII via a heterobifunktional crosslinker but the extent of stabilization after spermine-induced coprecipitation was lower in comparison to non-modified LHCII again. Furthermore it was possible to precipitate titanium dioxide with all kinds of polycationic molecules used in this work. Complex stability was not negatively influenced by this encapsulation. Effects on stabilizing against thermal stress have to be tested soon.rnWithin silica encapsulated LHCII shows an efficient inter-complex energy transfer. Because of this and the high extent of stabilization, silica encapsulated LHCII opens new possibilities towards its use in technical applications like dye-sensitized solar cells. rn
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-1533
URN: urn:nbn:de:hebis:77-39569
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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