Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-1531
Authors: Manfrin, Alberto
Title: Preparation and functional characterisation of recombinant silicatein-alpha from the sponge Suberites domuncula
Online publication date: 8-Jan-2015
Year of first publication: 2015
Language: english
Abstract: The marine world is an immense source of biodiversity that provides substances with striking potentials in medicinal chemistry and biotechnology. Sponges (Porifera) are marine animals that represent the most impressive example of organisms possessing the ability to metabolise silica through a family of enzymes known as silicateins. Complex skeletal structures (spicules) made of pure biogenic silica (biosilica) are produced under physiological conditions. Biosilica is a natural material comprising inorganic and organic components with unique mechanical, optical, and physico-chemical properties, including promising potential to be used for development of therapeutic agents in regenerative medicine. Unravelling the intimate physiological mechanisms occurring in sponges during the construction of their siliceous spicules is an on-going project, and several questions have been addressed by the studies proposed by our working group. In this doctoral work, the recombinant DNA technology is exploited for functional and structural characterisation of silicatein. Its precursors are produced as fusion proteins with a chaperone tag (named TF-Ps), and a robust method for the overexpression of native soluble proteins in high concentrations has been developed. In addition, it is observed and proven experimentally that the maturation of silicatein is an autocatalytic event that: (i) can be modulated by rational use of protease inhibitors; (ii) is influenced by the temperature of the environment; (iii) only slightly depends on the pH. In the same experimental framework, observations on the dynamics in the maturation of silicateins allow a better understanding of how the axial filaments form during the early stages of spicule construction. In addition, the definition of new distinct properties of silicatein (termed â structure-guidingâ and â structure-formingâ ) is introduced. By homology models and through comparisons with similar proteins (the cathepsins), domains with significant surface hydrophobicity are identified as potential self-assembly mediators. Moreover, a high-throughput screening showed that TF-Ps could generate crystals under certain conditions, becoming promising for further structural studies. With the goal of optimise the properties of the recombinant silicatein, implementation of new production systems are tried for the first time. Success in the expression of silicatein-type proteins in insect and yeast cells, constitute a promising basis for further development, towards the establishment of an efficient method for the production of a high-value pure and soluble protein.
Die marine Welt stellt eine immense Quelle an Biodiversität dar, die Stoffe mit beachtlichem Potential für die medizinische Chemie und die Biotechnologie bereitstellt. Schwämme (Porifera) sind marine Organismen und besitzen die einzigartige Fähigkeit, Glas mit Hilfe von Enzymen, den Silicateinen zu metabolisieren. Die komplexen, aus reinem biogenen Glas (Biosilikat) produzierten Skelettstrukturen (Spiculae) werden unter physiologischen Bedingungen produziert. Bei Biosilikat handelt es sich um ein natürliches Material, aus anorganischen und organischen Bestandteilen mit einzigartigen mechanischen, optischen und physikochemischen Eigenschaften. Darüber hinaus besitzt es ein vielversprechendes Potential in der Entwicklung therapeutischer Mittel innerhalb der regenerativen Medizin. Die physiologischen Mechanismen, welche an der Konstruktion der Glasspiculae beteiligt sind, konnten von unsere Arbeitsgruppe bereits weitgehend aufgeklärt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit Hilfe der rekombinanten DNA-Technologie eine funktionelle und strukturelle Charakterisierung des Silicateins durchgeführt. Dessen Vorläuferproteine wurden über eine Fusion zwischen dem Protein und einem Chaperon-Tag (TF-Ps) hergestellt. Für die Überexpression des nativen und löslichen TF-Ps in hohen Konzentrationen wurde eine spezielle Methode entwickelt. Des Weiteren wurde beobachtet und experimentell bestätigt, dass die Reifung des Silicateins ein autokatalytischer Vorgang ist, welcher: (i) durch den entsprechenden Einsatz von Protease-Inhibitoren moduliert werden kann, (ii) durch die umgebende Temperatur beeinflusst werden kann, und (iii) nur leicht vom pH-Wert abhängig ist. Beobachtungen eines Phasenwechsels während der Reifung des Silicateins erlauben zusätzlich ein besseres Verständnis darüber, wie sich die Axialfilamente während der frühen Phase der Spikulum-Konstruktion formieren. Dies führte zusätzlich zu Definitionen bestimmter Eigenschaften des Silicateins, die im Rahmen dieser Arbeit als â -tructure-guidingâ â und â -tructure formingâ â bezeichnet werden. Mit Hilfe von Homologie Modellen und durch den Vergleich mit ähnlichen Proteinen (Cathepsine), wurden Domänen mit signifikanter Oberflächenhydrophobizität als potentielle selbstassemblierende Mediatoren identifiziert. Zusätzlich zeigte ein high-throughput screening, dass TF-Ps unter bestimmten Bedingungen, Kristalle generieren können, die sich für weitere strukturelle Studien eignen. Neben der Optimierung der Eigenschaften des rekombinanten Silicateins, konnten erstmalig neue Produktionssysteme implementiert werden. Der Erfolg der Expression von Silikatein-artigen Proteinen in Insekten- und Hefezellen, liefert eine vielversprechende Basis für die weitere Entwicklung einer effizienten Methode zur Produktion von hochwertigen, rekombinanten, puren und löslichen Proteinen.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-1531
URN: urn:nbn:de:hebis:77-39548
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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