Authors:	Hamm, Rebecca
Title:	Mechanisms of resistance of tumor cells in response to treatment with the vacuolar H+-ATPase inhibitor archazolid B
Online publication date:	17-Dec-2014
Year of first publication:	2014
Language:	english
Abstract:	Resistance of cancer cells towards chemotherapy is the major cause of therapy failure. Hence, the evaluation of cellular defense mechanisms is essential in the establishment of new chemotherapeutics. In this study, classical intrinsic and acquired as well as new resistance mechanisms relevant in the cellular response to the novel vacuolar H+-ATPase inhibitor archazolid B were investigated. Archazolid B, originally produced by the myxobacterium Archangium gephyra, displayed cytotoxicity in the low nanomolar range on a panel of cancer cell lines. The drug showed enhanced cytotoxic activity against nearly all cancerous cells compared to their non-cancerous pendants. With regards to ABC transporters, archazolid B was identified as a moderate substrate of ABCB1 (P-glycoprotein) and a weak substrate of ABCG2 (BCRP), whereas hypersensitivity was observed in ABCB5-expressing cells. The cytotoxic effect of archazolid B was shown to be independent of the cellular p53 status. However, cells expressing constitutively active EGFR displayed significantly increased resistance. Acquired drug resistance was studied by establishing an archazolid B-resistant MCF-7 cell line. Experiments showed that this secondary resistance was not conferred by aberrant expression or DNA mutations of the gene encoding vacuolar H+-ATPase subunit c, the direct target of archazolid B. Instead, a slight increase of ABCB1 and a significant overexpression of EGFR as well as reduced proliferation may contribute to acquired archazolid B resistance. For identification of new resistance strategies upon archazolid B treatment, omics data from bladder cancer and glioblastoma cells were analyzed, revealing drastic disturbances in cholesterol homeostasis, affecting cholesterol biosynthesis, uptake and transport. As shown by filipin staining, archazolid B led to accumulation of free cholesterol in lysosomes, which triggered sterol responses, mediated by SREBP-2 and LXR, including up-regulation of HMGCR, the key enzyme of cholesterol biosynthesis. Furthermore, inhibition of LDL uptake as well as impaired LDLR surface expression were observed, indicating newly synthesized cholesterol to be the main source of cholesterol in archazolid B-treated cells. This was proven by the fact that under archazolid B treatment, total free cholesterol levels as well as cell survival were significantly reduced by inhibiting HMGCR with fluvastatin. The combination of archazolid B with statins may therefore be an attractive strategy to circumvent cholesterol-mediated cell survival and in turn potentiate the promising anticancer effects of archazolid B. Resistenz von Krebszellen gegenüber Chemotherapeutika ist der Hauptgrund für Therapieversagen. Im Hinblick darauf stellt die Evaluierung von zellulären Verteidigungsmechanismen einen essentiellen Schritt bei der Etablierung neuer Krebsmedikamente dar. In der vorliegenden Arbeit wurden daher klassische (intrinsische und erworbene) sowie neue Resistenzmechanismen untersucht, die bei der zellulären Antwort auf den neuen vakuolären H+-ATPase Inhibitor Archazolid B eine Rolle spielen. Archazolid B, welches ursprünglich aus dem Myxobakterium Archangium gephyra stammt, zeigte toxische Wirkung auf eine Auswahl verschiedener Krebszell-Linien bei Konzentrationen im unteren nanomolaren Bereich. Die abtötende Wirkung der Substanz war bei fast allen Tumorzellen im Vergleich zu den zugehörigen Normalzellen stärker ausgeprägt. Bei der Untersuchung von ABC-Transportern wurde Archazolid B als mäßiges Substrat von ABCB1 (P-Glykoprotein) und schwaches Substrat von ABCG2 (BCRP) identifiziert, wohingegen Hypersensitivität in ABCB5-exprimierenden Zellen beobachtet wurde. Der zytotoxische Effekt von Archazolid B stellte sich als unabhängig vom zellulären p53 Status heraus, jedoch zeigten Zellen mit konstitutiv aktivem EGFR eine deutlich gesteigerte Resistenz gegenüber der Substanz. Erworbene Resistenzmechanismen wurden anhand einer eigens etablierten Archazolid B-resistenten MCF-7 Zell-Linie untersucht. Eine abnorme Expression oder DNA-Mutation des Gens, welches für die vakuoläre H+-ATPase Untereinheit c (die direkte Zielstruktur von Archazolid B) kodiert, wurde nicht gefunden. Stattdessen scheinen ein leichter Anstieg von ABCB1, eine signifikante Überexpression von EGFR sowie eine reduzierte Proliferationsrate zu der erworbenen Resistenz beizutragen. Zur Identifizierung neuer Resistenzstrategien wurden omics-Daten von Blasenkrebs und Glioblastoma-Zellen analysiert. Diese wiesen auf deutliche Störungen der Cholesterolhomöostase, welche Biosynthese, Aufnahme und Transport umfassten, hin. Durch Filipin-Färbung konnte die Ansammlung von freiem Cholesterol in Lysosomen nachgewiesen werden. Vermittelt durch SREBP-2 und LXR führte dies unter anderem zum Anstieg von HMGCR, dem Schlüsselenzym der Cholesterolsynthese. Aufgrund zusätzlicher Störung der LDL Aufnahme sowie Beeinträchtigung der LDLR-Oberflächen-expression wurde neu-synthetisiertes Cholesterol als die Hauptquelle von Cholesterol unter Archazolid B-Behandlung identifiziert. Tatsächlich konnte die Menge an freiem Cholesterol sowie lebensfähigen Zellen durch zusätzliche Inhibierung der HMGCR mit Fluvastatin signifikant reduziert werden. Die Kombination von Archazolid B mit Statinen könnte daher eine attraktive Strategie darstellen, um Cholesterol-bedingtes Zellüberleben zu vermeiden und im Gegenzug das vielversprechende Antikrebspotential von Archazolid B zu potenzieren.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1516
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-39323
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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