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Authors: Steinmetz, Philipp Aloysius
Title: Signalerkennung und Signaltransduktion im DctA,DcuS-Sensor-Regulatorkomplex von Escherichia coli.
Online publication date: 27-Nov-2014
Language: german
Abstract: E. coli ist in der Lage unter aeroben sowie anaeroben Bedingungen C4-Dicarbonsäuren zur Energiekonservierung zu nutzen. Das DcuS/DcuR-Zweikomponentensystem detektiert diese und reguliert die Gene für den C4-Dicarboxylat-Transport und Metabolismus. Dabei hängt die Sensitivität der Sensorkinase DcuS für C4-Dicarbonsäuren von der Anwesenheit des aeroben Symporters DctA oder des anaeroben Antiporters DcuB ab. Diese bifunktionalen Transporter bilden mit DcuS über direkte Protein-Protein-Wechselwirkungen Sensoreinheiten. In dieser Arbeit wurden die Funktionen von DctA und DcuS im DctA/DcuS-Sensorkomplex analysiert. Mit DctA(S380D) wurde eine Variante des Transporters identifiziert, in der die regulatorische Eigenschaft von der katalytischen Funktion entkoppelt ist. Stämme von E. coli, die den DctA(S380D)/DcuS-Sensorkomplex enthielten, waren in der Lage C4-Dicarbonsäuren wahrzunehmen, obwohl die Transportfunktion von DctA inaktiviert war. Zudem wurden Unterschiede in den Substratspektren von DctA und DcuS festgestellt. Citrat, ein guter Effektor des DctA/DcuS-Sensorkomplexes, wurde durch DctA nicht gebunden oder transportiert. Anhand von Titrationsexperimenten mit variierenden DctA-Mengen wurde außerdem nachgewiesen, dass die Sensitivität von DcuS für seine Effektoren von der DctA-Konzentration abhängig ist. Es konnte gezeigt werden, dass DctA im DctA/DcuS-Sensorkomplex nicht an der Erkennung von C4-Dicarbonsäuren beteiligt ist. DcuS stellt die Signaleingangsstelle des Komplexes dar, während DctA durch seine Anwesenheit die Sensorkinase in eine funktionsbereite oder sensitive Form überführt, die auf Effektoren reagieren kann. Darüber hinaus wurde die Rolle der Transmembranhelices TM1 und TM2 von DcuS für die Funktion und Dimerisierung der Sensorkinase untersucht. Durch Sequenzanalysen wurden â SmallxxxSmallâ -Motive, deren Relevanz als Dimerisierungsschnittstellen bereits in Transmembranhelices anderer Proteine nachgewiesen wurde, in TM1 sowie TM2 identifiziert. Die Homodimerisierung beider Transmembrandomänen wurde im GALLEX Two-Hybrid System nachgewiesen, wobei die TM2-TM2-Interaktion stärker war. Die Substitution G190A/G194A im SxxxGxxxG-Tandemmotiv von TM2 rief zudem einen deutlichen Funktionsverlust der Sensorkinase hervor. Dieser Aktivitätsverlust korrelierte mit Störungen der Homodimerisierung von TM2(G190A/G194A) sowie DcuS(G190A/G194A) bei bakteriellen Two-Hybrid Messungen im GALLEX- bzw. BACTH-System. Demzufolge agiert Transmembranhelix 2 mit seinem SxxxGxxxG-Sequenzmotiv als wesentliche Homodimerisierungsstelle in DcuS. Die Dimerisierung von DcuS ist essentiell für die Funktion der Histidinkinase. Zusätzlich wurde bei fluoreszenzmikroskopischen Studien durch Koexpression von DcuS bzw. DctA die zelluläre Kolokalisierung von DctA und DcuR mit DcuS sowie DauA mit DctA nachgewiesen. Die DctA/DcuS-Sensoreinheit kann demnach zum DauA/DctA/DcuS/DcuR-Komplex erweitert werden.
E. coli is able to utilize C4-dicarboxylates for energy metabolism under aerobic and anaerobic conditions. The DcuS/DcuR two-component system detects these substrates and regulates the genes for C4-dicarboxylate transport and metabolism. The responsiveness of the sensor DcuS for C4-dicarboxylates, however, depends on the presence of the aerobic symporter DctA or the anaerobic antiporter DcuB, respectively. Both bifunctional transporters form sensor units with the sensor kinase DcuS via direct protein-protein interactions. The objective of this thesis was to analyze the functions of DctA and DcuS in the DctA/DcuS sensor complex. With DctA(S380D) a variant of the transporter was identified in which the regulatory quality and catalytic function is uncoupled. E. coli strains containing the DctA(S380D)/DcuS sensor complex are still capable of perceiving C4-dicarboxylates, even though the transport by DctA is disrupted. Furthermore, DctA and DcuS feature different substrate spectra. The tricarboxylic acid citrate serves as an excellent effector for the DctA/DcuS sensor complexes, yet it is not bound or transported by DctA. Additionally, titration experiments with varying DctA contents demonstrate that the effector responsive state of DcuS depends on the DctA concentration. Thus, DctA plays no part in effector recognition in the DctA/DcuS sensor complex. The signal input site of the complex resides in DcuS, whereas the presence of DctA transfers the sensor kinase DcuS to the responsive state, enabling C4-dicarboxylate recognition. In addition, the contribution of the transmembrane helices TM1 and TM2 of DcuS for the function and dimerization of the sensor kinase were analyzed. SmallxxxSmall sequence motifs, which provide the framework for TM-TM association, were identified in TM1 and TM2. The homodimerization of both TMs was verified by the GALLEX two-hybrid system, with TM2-TM2 displaying stronger interaction. The substitution G190A/G194A in the SxxxGxxxG motif of TM2 results in a notable defect of the sensor kinase. This loss of activity of DcuS correlates with the disrupted homodimerization of TM2(G190A/G194A), as well as, DcuS(G190A/G194A) in bacterial two-hybrid studies using the GALLEX or BACTH systems, respectively. Consequently, TM2 represents a central interaction site for the DcuS-DcuS dimerization, which is essential for the function of the sensor kinase. Furthermore, the co-localization of DctA and DcuR with DcuS, as well as, DauA with DctA was demonstrated by fluorescence microscopy studies, while co-expressing DcuS or DctA, respectively. Therefore, a DauA/DctA/DcuS/DcuR complex can be debated.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-1504
URN: urn:nbn:de:hebis:77-39139
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: 184 S.
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