Authors:	Richter, Andreas
Title:	Biochemische Untersuchungen des Lichtsammlerprotein (LHCP) im Komplex mit seinem Chaperon, dem plastidären Signalerkennungspartikel cpSRP
Online publication date:	21-Nov-2014
Year of first publication:	2014
Language:	german
Abstract:	Das Lichtsammlerprotein (light harvesting chlorophyll a/b-binding protein, LHCP) ist das Apoprotein des Haupt-Lichtsammelkomplexes (LHCII) und stellt das häufigste Membranprotein der Erde dar. Nicht nur aufgrund seiner Abundanz, sondern auch wegen seiner speziellen Translokation als stark hydrophobes Membranprotein durch hauptsächlich wässrige Milieus von cytosolischen Ribosomen bis in die Thylakoidmembran der Chloroplasten ist der Biogeneseweg dieses Proteins von besonderem Interesse. LHCP ist kernkodiert und wird nach seinem Import in Chloroplasten als Transitkomplex mit dem stromalen Signalerkennungsprotein (cpSRP) zur Thylakoide geleitet. Der cpSRP-Komplex besteht aus dem cpSRP43 mit Chaperonfunktion für das LHCP sowie dem Co-Chaperon cpSRP54, welches eine entscheidende Rolle in der stromalen Zielführung des Transitkomplexes spielt. Sowohl die Proteinkonformation des LHCP während seiner Biogenese als auch der in vivo Faltungsablauf während der Thylakoidinsertion sind noch völlig unklar. Mithilfe der Elektronen-paramagnetischen Resonanz (EPR-)Spektroskopie sollte in dieser Arbeit der Faltungszustand des LHCP im Transitkomplex mit dem cpSRP oder in Teilkomplexen davon ermittelt werden.\r\nKopplungen von cpSRP43 und LHCP bestätigten, dass das Chaperon als Minimaleinheit zur quantitativen Solubilisierung des Membranproteins genügt. Gelfiltrationschromatographische (GFC-) Untersuchungen solcher Komplexe wiesen jedoch mit einem apparenten MW von â ¥ 600 kDa ein sehr hochmolekulares Laufverhalten auf. Variierende Proteinstöchiometrien im Komplex zeigten in densitometrischen Auswertungen eine undefinierte Aggregation. Zusätze von Agenzien zur Vermeidung unspezifischer Wechselwirkungen wie z.B. Detergentien oder auch Salzzugabe zeigten keinen Einfluss auf die Aggregate. Volllängen-Transitkomplexe dagegen wiesen trotz unterschiedlichem Angebot von Einzelproteinen reproduzierbar definierte Stöchiometrien auf. Diese zeigten eine LHCP:cpSRP43-Stöchiometrie von 1,25. Dennoch hatten diese Komplexe mit einem apparenten MW von > 300 kDa einen mindestens dimeren Assemblierungsgrad. Eine Voraussetzung für eindeutige EPR-spektroskopische Distanzmessungen zwischen definierten Positionen im LHCP ist jedoch dessen monomolekularisiertes Vorliegen im Chaperonkomplex. Die Darstellung von ternären Transitkomplexen mit einem zu erwartenden apparenten MW von ~175 kDa war auch durch Zusatz verschiedener Proteinaggregationshemmer nicht möglich. Transitkomplexe mit einer verkürzten Version des cpSRP54 zeigten schließlich eine definierte 1:1-Komplexstöchiometrie bei gleichzeitiger polydisperser Komplexzusammensetzung. Es konnten ~60% dieser sogenannten 54M-Transitkomplexe nach GFC-Daten und densitometrischer Auswertung als potentiell ternär eingeschätzt werden. Darüber hinaus gelang es solche Ansätze durch GFC-Fraktionierung zusätzlich von oligomerisierten Spezies aufzureinigen. Dennoch zeigten die Präparate vor GFC-Fraktionierung ein (noch) zu hohes Aggregationssignal im Hintergrund und nach Fraktionierung ein zu schwaches Signal, um eine eindeutige Aussage der EPR-Daten zuzulassen. Dennoch bietet dieses ausgearbeitete Komplexbildungsprotoll in Verbindung mit der Verwendung von verkürztem cpSRP54 eine solide Basis, um weitere Versuche zu EPR-Messungen an cpSRP-gebundenem LHCP durchzuführen. \r\n The light harvesting chlorophyll a/b-binding protein (LHCP) is the apoprotein of the major light harvesting complex II (LHCII) and represents the most abundant membrane protein on Earth. It is of special interest not only due to its abundance, but also because the transport of this highly hydrophobic protein through several aqueous compartments is a challenging part of LHCII biogenesis. LHCP is nuclear encoded and post-translationally imported into the chloroplast. In the stroma LHCP constitutes a complex with the chloroplastic signal recognition particle (cpSRP). This so-called transit complex is delivered to the thylakoid membrane. The cpSRP complex comprises the cpSRP43 which functions as a chaperone for LHCP and the co-chaperone cpSRP54 which is crucial for the stromal targeting of the transit complex. The major goal of this work was to investigate the folding state of LHCP in the transit complex with cpSRP or parts of it by using electron paramagnetic resonance (EPR-) spectroscopy.\r\nComplex formation of cpSRP43 and LHCP confirmed that the chaperone as a minimal unit is enough for the quantitative solubilization of the membrane protein. However, gel filtration chromatography (GFC) of these complexes showed quite a high apparent molecular weight of â ¥ 600 kDa. A variable protein stoichiometry in the complex, as assessed by gel densitrometry, exhibited the complexes to be non-specific aggregates. Additives such as detergents or salt to avoid this unspecific aggregation did not show any influence. By contrast, full length transit complexes reproducibly displayed a defined protein stoichiometry of cpSRP43:LHCP-stoichiometry 1,25, despite a varying stoichiometry of the components offered during complex formation. Nevertheless these complexes also assembled, at least into dimers, as indicated by their apparent molecular weight in GFC of > 300 kDa. This was prohibitive for EPR measurements that require a monomolecular of the complexes to be analyzed. The addition of protein aggregation inhibitors did not either achieve non-aggregated transit complexes with an anticipated apparent molecular weight of ~175 kDa . Transit complexes with a shortened version of the cpSRP54 protein finally showed a defined 1:1-stoichiometry, albeit with a polydisperse complex composition. According to GFC-data and densitometric analysis it was assumed that ~60% of these so-called 54M transit complex represent a ternary species. Moreover, these preparations were purified by GFC in order to isolate the tenary from oligomeric complexes. Even with these samples, conclusive results by EPR-spectroscopy could not be achieved. On one hand the samples before GFC-separation still showed too high an amount of aggregation signal, on the other hand in GFC-purified samples the EPR signal was too weak. However, this established protocol of complex formation, using the shortened version of cpSRP54, will presumably be a useful basis for carrying out further EPR studies on cpSRP-bound LHCP. \r\n
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1495
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-39021
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	188 S.
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