Authors:	Helfrich, Andreas
Title:	Methodenentwicklung zur Charakterisierung von metallischen Nanopartikeln und deren potentieller Einsatz bei der Analyse von Biomolekülen mittels ICP-MS Kopplungstechniken
Online publication date:	24-Nov-2014
Year of first publication:	2014
Language:	german
Abstract:	Die qualitative und quantitative Analyse von Biomolekülen hat in den letzten Jahren und Jahrzehnten immer mehr an Bedeutung gewonnen. Durch das Aufkommen und die kontinuierliche Weiterentwicklung neuer Separations- und Detektionsmethoden und deren Verbindung miteinander zu leistungsfähigen Einheiten, erlangte man Schritt für Schritt neue Erkenntnisse bei ihrer Untersuchung. Die Elementmassenspektrometrie als nachweisstarke Detektionsmethode wird von vielen wissenschaftlichen Arbeitsgruppen bei der Trennung und Quantifizierung von Proteinen und Metalloproteinen mittels Detektion der in den Biomolekülen vorkommenden Metalle und Heteroatome angewendet. Heteroatome (z.B. Schwefel, Phosphor) haben im Plasma des ICP-MS (inductively coupled plasma - mass spectrometer) schlechte Ionisationseigenschaften und dementsprechend deutlich höhere Nachweisgrenzen als Metalle. Ein Ansatz, schlecht oder nicht detektierbare Verbindungen (also solche, die keine Metalle oder Heteroatome enthalten) mit dem ICP-MS sichtbar zu machen, ist die Markierung der selbigen mit Metallionen oder -cluster. rnIn dieser Arbeit ist es gelungen, der Analyse ganz unterschiedlicher Substanzklassen, zum einen metallische Nanopartikel und zum anderen Proteine, neue Impulse zu geben und zukünftiges Potential bei der Anwendung gekoppelter Techniken zur Separation und Detektion aufzuzeigen. Durch die Verwendung einer alten, aber neu konzipierten Trenntechnik, der Gelelektrophorese (GE), und deren Kopplung an einen modernen Detektor, dem ICP-MS, kann die für die Proteinanalytik weit verbreitete Gelelektrophorese ihr enormes Potential bei der Trennung verschiedenster Verbindungsklassen mit der exzellenten Nachweisstärke und Elementspezifität des ICP-MS verbinden und dadurch mit deutlich weniger Arbeitsaufwand als bisher qualitative und auch quantitative Ergebnisse produzieren. Bisher war dies nur mit großem präparativem Aufwand unter Verwendung der laser ablation möglich. Bei der Analyse von Nanopartikeln konnte aufgezeigt werden, dass durch die GE-ICP-MS-Kopplung aufgrund der guten Trenneigenschaften der GE vorhandene Spezies bzw. Fraktionen voneinander separiert werden und mit Hilfe des ICP-MS Informationen auf atomarem Niveau gewonnen werden können. Es war möglich, das atomare Verhältnis der Metallatome im Kern und der Schwefelatome in der Ligandenhülle eines Nanopartikels zu bestimmen und damit die Größe des Partikels abzuschätzen. Auch konnte die Anzahl der Goldatome in einem dem Schmid-Cluster ähnlichen Nanopartikel bestimmt werden, was vorher nur mit Hilfe von MALDI-TOF möglich war. Bei der Analyse von Biomolekülen konnte auf einfache Weise der Phosphorylierungsgrad verschiedener Proteine bestimmt werden. Auch bei kleinen Molekülen erzielt die Gelelektrophorese ausgezeichnete Trennergebnisse, wie z. B. bei der Analyse verschiedener Brom- und Iodspezies.rnDie stöchiometrische Kopplung eines Proteins an einen Nanopartikel, ohne eine der beiden Verbindungen in einem größeren Maße zu verändern, stellte jedoch eine Herausforderung dar, die im Rahmen dieser Arbeit nicht vollständig gelöst werden konnte. Verschiedene Ansätze zur Kopplung der beiden Substanzen wurden erprobt, jedoch führte keine zu dem gewünschten Ergebnis einer stöchiometrisch vollständigen und spezifischen Modifikation eines Proteins mit einem Nanopartikel. Durch das Potential der GE-ICP-MS-Kopplung bei der Analyse beider Substanz-klassen und dem Beweis der Praktikabilität und Zuverlässigkeit der Methode ist jedoch der Grundstein für weitere Forschungen auf diesem Gebiet gelegt worden. Ist eine geeignete chemische Kopplung der beiden Substanzklassen gefunden und beherrscht, steht auf analytischer Seite eine leistungsstarke Kombination aus Trennung und Detektion zur Verfügung, um die Quantifizierung von Proteinen entscheidend zu verbessern.rn The quantitative and qualitative analysis of biomolecules became more important during the last years and decades. Due to the continuous enhancements and the appearance of new separation and detection techniques and its hyphenation to powerful units, more insight in analysis of biomolecules could be gained step by step. Elemental mass spectrometry as a powerful detector is used by many study groups for separation and detection of proteins and metalloproteins by detection of the metals and heteroatoms present in the molecules.However, heteroatoms (e.g. sulphur, phosphorous) exhibit unfavourable ionization energies in the plasma of an inductively couples plasma mass spectrometer (ICP-MS) which leads to significantly higher detection limits compared to that of metals. An approach to improve or enable detectability of biomolecules not containing metals or heteroatoms by using ICP-MS is to tag them with metal ions or clusters.rnIn this work new stimulus for the analysis of rather different categories of molecules like metallic nanoparticles and proteins is provided and the potential of hyphenated techniques is shown. Hyphenation of the ancient , for protein analysis widely applied, well known but newly designed separation technique of gel electrophoresis (GE) to a modern detector, the ICP-MS, combines a high performance separation technique for different categories of molecules with a highly sensitive and specific detector. Qualitative and quantitative results can be obtained with less mechanistic build-up where before laser ablation techniques had to be used. Analysis of nanoparticles demonstrate the good separation capabilities of the new GE-ICP-MS set-up. Different species, resp. fractions, could be isolated and information at atomic level could be revealed. It was possible to determine the atomic ratio of the metal atoms in the core and the sulphur atoms in the shell of a nanoparticle. Hence, the size of the particle could be estimated. The number of gold atoms in a Schmid cluster analogue could be determined by GE-ICP-MS where so far MALDI-TOF needed to be applied. Furthermore, the phosphorylation degree of different proteins could be easily determined. GE can also be used for the analysis of small molecules which was demonstrated by analysis of different bromine and iodine species.rn The stoichiometric coupling of a protein and a nanoparticle without significantly altering the characteristic of either of them could not be accomplished within this work. Different approaches have been tested but none of them provided a stoichiometric, complete and specific modification of the protein by covalent attachment of a nanoparticle. However, the shown potential of GE-ICP-MS hyphenation for the analysis of both nanoparticles and proteins and the proof of practicability and reliability of the method represent the corner stone for further research. As soon as a suitable coupling for nanoparticles and proteins is found and controlled, the analytical tools are available. The powerful hyphenation of a separation and detection technique is available to improve quantification of proteins significantly.rn
DDC:	540 Chemie 540 Chemistry and allied sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1494
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-39015
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	4182 S.
Appears in collections:	JGU-Publikationen