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Authors: Gemechu, Mekonnen
Title: Mechanismen der Aktivierung und Detoxifizierung von Aflatoxin B 1 in verschiedenen Leberzelltypen von Ratten, Mäusen und Waldmurmeltieren
Online publication date: 1-Jan-2000
Language: german
Abstract: Zusammenfassung: Die Applikation des Mykotoxins Aflatoxin B1 (AFB1) führt in der Ratte zu Lebertumoren hepatozellulären Ursprungs, während bisher keine transformierende Wirkung dieses Mykotoxins auf Kupffer- und Endothelzellen (Nichtparenchymzellen, NPC) nachgewiesen werden konnte. Diese Resistenzmechanismen der NPC gegenüber AFB1 wurden im ersten Teil dieser Arbeit untersucht. AFB1 ist per se inaktiv, wird jedoch durch Verstoffwechselung in den chemisch reaktiven, an DNA bindenden Metaboliten AFB1-8,9-Epoxid überführt. Daneben stellt die enzymatische Hydroxylierung von AFB1 am Kohlenstoff-9a zum Aflatoxin M1 eine Detoxifizierung dar. Durch HPLC-Analyse der AFB1-Metabolite konnte gezeigt werden, daß in Nichtparenchymzellen (NPC) das Verhältnis von 9a-Hydroxylierung zu 8,9-Epoxidierung höher als in Parenchymzellen (PC) ist. Die AFB1-9a-hydroxylase fördert insbesondere in den NPC der Leber die Bildung des weniger gentoxischen Metaboliten AFM1 und konkurriert daher um die Aktivierung von AFB1 zum mutagenen und kanzerogenen 8,9-Epoxid. Dieser metabolische Unterschied scheint also einen Beitrag zur Resistenz der NPC der Leber gegenüber der hepatokanzerogenen Wirkung von AFB1 zu leisten. Da ein Synergismus zwischen der AFB1-Exposition und einer Infektion mit dem Hepatitis B-Virus (HBV) beim Menschen bezüglich des Auftretens von hepatozellulären Karzinomen zu bestehen scheint, wurde im zweiten Teil dieser Arbeit untersucht, ob die metabolische Aktivierung von AFB1 durch eine HBV-Infektion verstärkt wird. In einem Vergleich der Biotransformation von AFB1 mit mikrosomalen Leberfraktionen von transgenen HBV-Mäusen und Kontrollmäusen wurde keine signifikanten Unterschiede festgestellt. Dagegen wurde bei Virus-infizierten Waldmurmeltieren eine deutlich reduzierte Bildung des AFB1-8,9-Epoxids beobachtet. Es konnte z.T. ein Zusammenhang zwischen den verschiedenen Stadien der Leberschädigung und den Metabolismusraten festgestellt werden, wobei die metabolische Aktivierung mit zunehmender Leberschädigung abzunehmen scheint. Auch hinsichtlich der Aktivitäten verschiedener Cytochrom P450 abhängiger Monooxygenasen wurde eine weitgehende Übereinstimmung mit den durch HPLC ermittelten Metabolitenprofilen des AFB1 beobachtet. Diese Studien mit subzellulären Leberfraktion der transgenen HBV-Mäusen und der Waldmurmeltieren zeigen, daß die Interaktion zwischen Hepatitis und AFB1 nicht mit der verstärkten metabolischer Aktivierung von AFB1 zu erklären ist. TGF-ß1, aus der Gruppe der Cytokine, wird als Mediator bei Entzündungsprozessen in der Leber so z.B. im Verlauf einer Virushepatitis freigesetzt. Aufgrund der besonderen Bedeutung des murinen CYP2A5 (ortholog zum humanen CYP2A6) bei der Aktivierung von AFB1 wurde der Einfluß von TGF-ß1 auf CYP2A5 in Primärkulturen von Maushepatozyten untersucht. Durch Messung der Aktivität der Cumarin-7-hydroxylase sowie durch Bestimmung der Proteinmenge von CYP2A5 mittels Western Blotting konnte zunächst die Induzierbarkeit des CYP2A5-Isoenzyms durch Phenobarbital in kultivierten Hepatozyten der Maus gezeigt werden. Nur bei einer niedrigen TGF-ß1-Konzentration wurde eine leicht erhöhte Expression von CYP2A5 festgestellt, ansonsten führte die Behandlung der kultivierten Maushepatozyten mit TGF-ß1 zu einer dosisabhängigen Verminderung der Expression von CYP2A5.
Chronic administration of Aflatoxin B1 (AFB1) to rats gives rise to hepatocellular carcinomas without affecting Kupffer and endothelial cells. The enzymatic conversion of AFB1 to AFB1-8,9-epoxide is the critical step in the activation of the mycotoxin, while the conversion of AFB1 to Aflatoxin M1 catalysed by the AFB1-9a-hydroxylase, is considered to be a detoxification route for the toxin. In the present study the distribution and inducibility of AFB1-9a-hydroxylase were analysed in microsomes derived from freshly isolated liver parenchymal (PC) and nonparenchymal cells (i.e. Kupffer + endothelial cells, NPC). AFB1-9a-hydroxylase activity was clearly measurable in NPC and the relative ratio of 9a-hydroxylation to 8,9-epoxidation was comparatively higher in NPC than in PC. These results suggest that the AFB1-9a-hydroxylase activity might be particularly important in NPC to protect these cells from the hepatocarcinogenic effects of AFB1 by converting it to a significantly less mutagenic metabolite and thus reducing the amount available for epoxidation.Chronic hepatitis B virus infection as well as consumption of food contaminated with the mycotoxin AFB1 are considered to be two major risk factors for the development of primary liver cancer in humans. Furthermore, epidemiological surveys indicate that hepatitis B-virus (HBV) and AFB1 might act synergistically to induce liver cancer. In this study, the hypothesis that the metabolic activation of AFB1 to AFB1-8,9-epoxide could be enhanced in hepatitis and associated liver injury, was tested in two experimental models, namely in mice transgenic for the HBV large envelope polypeptide and in woodchucks, chronically infected with the woodchuck hepatitis virus. Liver microsomes were incubated with radiolabeled AFB1, the resulting aflatoxin B1-8,9-epoxide was trapped as a glutathione conjugate and its formation rate was determined by reversed-phase HPLC analysis. No difference in the microsomal activation of AFB1 was observed between HBV-transgenic and non-transgenic mice, whereas in hepatitis virus positive woodchucks, the activation of AFB1 to aflatoxin B1-8-9-epoxide was significantly reduced when compared to virus free animals; moreover the extent of the reduction was dependent on the severity of the hepatitis. Thus, the results of this comparative in vitro study stress the importance of other interaction mechanisms than increased activation of AFB1 in the synergistic interaction between AFB1 and HBV. In relation to the interaction study between HBV and AFB1, the possible modulation of CYP2A5 expression by TGF-ß1 was investigated in primary mouse hepatocyte cultures. TGF-ß1, a prototypic member of cytokine family, is elevated during inflammatory reactions for example following acute and chronic hepatitis. Among cytochrome P450s, CYP2A5 in mouse (orthologous to human CYP2A6) is of interest, as it is involved in the metabolic activation of AFB1 as well as because of its unique feature being expressed following liver injury. Initially, the inducibility of CYP2A5 by phenobarbital was demonstrated by measuring the activity of CYP2A5 mediated coumarin 7-hydroxylase and analysing the corresponding protein by western blot. While only low concentrations of TGF-ß1 increased CYP2A5 expression marginally and variably, exposure of hepatocytes to higher doses of TGF-ß1 down-regulated basal and phenobarbital-induced CYP2A5 level in a dose dependent fashion, suggesting that TGF-ß1 may not be directly involved in the up-regulation of CYP2A5 expression during liver injury.
DDC: 540 Chemie
540 Chemistry and allied sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-1413
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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