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Authors: Schröder, Jan
Title: Differenzielle Expression von Tubulin-Genen bei der Entwicklung von Blattzellen der Gerste (Hordeum vulgare L.)
Online publication date: 1-Jan-2000
Language: german
Abstract: Die Morphogenese einer Pflanzenzelle wird in großem Maße durch die Dynamik kortikaler Mikrotubuli (MT) bestimmt, die auf die Zellwandsynthese Einfluß nehmen. In dieser Arbeit wurden die Transkriptmengen der alpha-Tubulin-Isotypen und des gamma-Tubulin während der Entwicklung des Gerstenblattes analysiert, um Zusammenhänge zu bereits beschriebenen Umwandlungen im kortikalen MT-Cytoskelett der Mesophyllzellen aufzudecken. Erstmals konnte bei einer höheren Pflanze die Genexpression auf RNA-Ebene innerhalb einer Tubulin-Multigenfamilie im Verlauf der Blattentwicklung umfassend dargestellt werden.Es wurden blattspezifische cDNA-Bibliotheken erstellt und mittels RT-PCR homologe DNA-Gensonden für die Screeningprozesse der cDNA-Bibliotheken hergestellt. cDNA-Sequenzen von alpha-, beta-, und gamma-Tubulin konnten isoliert werden. Weitere, weniger abundante alpha-Tubulin-Sequenzen wurden während zusätzlicher Screeningrunden über PCR-Ausschluß häufig vertretener, bereits bekannter Isotypen isoliert.Die cDNA-Sequenzen von insgesamt fünf verschiedenen Isotypen des alpha-Tubulin konnten aufgeklärt werden, drei Isotypen wiesen bis zu fünf im nicht kodierenden 3´-Bereich verkürzte Varianten auf, die aber in ihrer Anzahl deutlich unterrepräsentiert waren. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen umfassten bei drei Isotypen 451 Aminosäuren (AS), zwei Isotypen waren im C-Terminus um eine bzw. um zwei AS kürzer. Die fünf alpha-Tubulin-Isotypen wiesen charakteristische Expressionsmuster auf, die in drei Klassen unterteilbar waren. Die Isotypen HVATUB1 und HVATUB5 (MT-Band-Isotypen) hatten den maximalen Gehalt in Blattbereichen, in denen auch hauptsächlich Mesophyllzellen mit kortikalen MT-Bänderungen vorkommen, wobei HVATUB5 den am schwächsten exprimierte Isotyp darstellte. HVATUB3 (Random-MT-Isotyp) zeigte die stärksten Expressionsraten. Die im Meristem und meristemnahen Bereichen bereits recht hohe Abundanz erreichte erst nach der Zellstreckungszone in einer Blattzone das Maximum, in dem hauptsächlich Mesophyllzellen mit zerstreut angeordneten MT anzutreffen sind. Die Isotypen HVATUB2 und HVATUB4 (MImax-Isotypen) waren in mitotisch aktiven, basalen Blattbereichen dominant.Die cDNA-Sequenz vom gamma-Tubulin der Gerste, HVGTUB, wurde ermittelt; die abgeleitete Aminosäuresequenz bestand aus 469 AS. Das Auftreten einer im nicht kodierenden 3´-Bereich kürzeren Variante konnte erstmals bei pflanzlichem gamma-Tubulin beschrieben werden. Southernblot-Analysen ließen darauf schließen, daß gamma-Tubulin nur als Einzelkopie im Genom der Gerste vorkommt. gamma-Tubulin wurde im mitosereichen Meristem der Blattbasis am stärksten exprimiert. Da die Abnahme der Transkriptmenge weitaus langsamer verlief als die Abnahme der Zellteilungsaktivität, ist anzunehmen, daß gamma-Tubulin neben der Erfüllung von mitose- und zellteilungsspezifischen Funktionen auch eine Rolle im Zusammenhang mit der Dynamik des kortikalen MT-Cytoskeletts spielt. Einen ersten Schritt zur Aufklärung der Genfamilie des beta-Tubulin bei Gerste stellt die Isolierung drei verschiedener cDNA-Sequenzen von beta-Tubulin dar.
The shape of plant cells is determined by the texture of the cell wall, which, in turn, is controlled by cortical microtubule (MT) - arrays, e.g. in developing mesophyll cells. The aim of the thesis was to test whether there is a correlation between the cell-shape-specific dynamics of cortical MT-arrays and the transcript level of tubulin isotypes. The plant model system used was a developing barley leaf with characteristic successions in microtubular arrays related to the establishment of the cell shapes within the leaf.Leaf-specific cDNA-libraries were prepared and screened with conserved homologous RT-PCR derived tubulin-specific DNA probes. In total, five clones of alpha-, three of beta-, and one of gamma-tubulin could be isolated and characterized. Low-abundance alpha-tubulin isotypes were discriminated via PCR-mediated exclusion of high-abundance isotypes.Among the identified five different isotypes of alpha-tubulin (length of 449 to 551 amino acids) there were three showing alternative polyadenylation sites. The isotype mRNAs could be related with respect to their abundance to the appearance/dissappearence of different MT-arrays. MT-band-related isotypes (HVATUB1 and HVATUB5) were expressed preferentially in leaf sections containing mesophyll cells with cortical MT-bands. The mRNA of the random-MT-isotype (HVATUB3) was already found in meristematic leaf regions, but the maximum expression occurred in leaf tissue exhibiting post-mitotic, elongated cells with randomly organized cortical MT-arrays. The mitosis-related isotypes (HVATUB2 and HVATUB4) were dominant in meristematic, basal leaf tissue with a high mitotic index. The overall relative abundance of the isotypes was as following: HVATUB5 << HVATUB4 < HVATUB1 << HVATUB2 < HVATUB3.The barley gamma-tubulin isolated had a deduced sequence of 469 amino acids and is the first plant gamma-tubulin described with an alternative polyadenylation site. Southern blot analysis revealed that barley gamma-tubulin is a single-copy gene. Highest expression of gamma-tubulin was found in basal leaf segments with high mitotic activity. Yet, the amount of gamma-tubulin-mRNA declined much slower than the abundance of mitotic active cells. It therefore appears likely that plant cells require gamma-tubulin not only for mitosis and cytokinesis, but possibly also for processes at later phases of the cell cycle (as e.g. organization of the cortical MT-array).In a first attempt to analyze the barley beta-tubulin gene family three different beta-tubulin-specific cDNA-clones could be isolated, and one clone was sequenced completely.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-1407
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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