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Authors: Hollenbach, Stephan
Title: Bedeutung endogener Faktoren für Steady-State- Level und Reparatur oxidativer DNA-Modifikationen in Säugerzellen
Online publication date: 1-Jan-2000
Language : german
Abstract: Die endogene Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) - wie beispielsweise Hydroxyl-Radikale, Superoxid-Radikalanionen, Wasserstoffperoxid und Singulett-Sauerstoff - bei essentiellen Stoffwechselreaktionen in allen aeroben Lebewesen stellt eine potentielle Gefahr für die Integrität der DNA in jeder Zelle dar. ROS generieren in der DNA unter anderem oxidative DNA-Modifikationen (zum größten Teil wahrscheinlich 8-Hydroxyguanin (8-oxoG)), welche wiederum zu einem Teil zu Mutationen führen.In dieser Arbeit wurden Untersuchungen vorgenommen, in welchem Ausmaß zum einen die Steady-State-Level oxidativer DNA-Schäden in Säugerzellen zum anderen die Reparaturgeschwindig-keiten solcher DNA-Modifikationen durch verschiedene endogene Faktoren beeinflußt werden.Im Mittelpunkt der Arbeit stand dabei die Charakterisierung der 8-Hydroxyguaninglykosylase der Säugerzellen. Sie ist das Produkt des OGG1-Gens, das erst 1997 kloniert wurde. In transfizierten Zellinien konnte durch eine konstitutive Überexpression des menschlichen OGG1-Gens demonstriert werden, daß die Reparatur von induzierten oxidativen Basenmodifikationen bis zu dreifach beschleunigt wird und daß eine Korrelation zwischen dem Grad der Überexpression und der Reparaturrate besteht. Dagegen waren die Steady-State-Level der oxidativen DNA-Schäden durch die Überexpression unbeeinflußt. Sowohl bei den spontanen Mutationsraten als auch bei den durch oxidative Schädigungen induzierten Mutationsfrequenzen konnte keine Erniedrigung bedingt durch die hOGG1-Überexpression beobachtet werden.Weitere Untersuchungen zur Bedeutung von Ogg1-Protein konnten in Mäusezellen durchgeführt werden, in denen das OGG1-homologe Mäusegen, mOGG1, homozygot inaktiviert (mOGG1(-/-)) worden war. Hierbei konnte gezeigt werden, daß in den mOGG1-defizienten Zellen im Vergleich zu den entsprechenden Wildtyp-Zellen (mOGG1(+/+)) eine Reparatur induzierter oxidativer Basenmodifikationen erst nach 8 h einsetzt, während in den Kontrollzellen schon nach 3-4 h 50 % der Modifikationen repariert waren. Die Steady-State-Level oxidativer Modifikationen in mOGG1(-/-)-Zellen waren in immortalisierten, schnell proliferierenden Mäusefibroblasten nur um den Faktor 1.4, in primären Mäusehepatocyten jedoch um den Faktor 2.5 gegenüber den Wildtyp-Zellen erhöht.Inwieweit das menschliche Reparaturprotein Xrcc1 (X-ray repair cross complementing group 1) auch an der Prozessierung oxidativer DNA-Modifikationen beteiligt ist, und ob dabei möglicherweise eine Interaktion mit Ogg1 vorliegt, wurde in der XRCC1-defizienten CHO-Zellinie EM9 untersucht. Dabei wurde ermittelt, daß weder die Steady-State-Level noch die Reparaturkinetiken der oxidativen Basenmodifikationen durch die XRCC1-Defizienz beeinflußt werden. Aufgrund weiterer Ergebnisse kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, daß das Xrcc1-Protein zumindest am Ligationsschritt während der Reparatur oxidativer DNA-Schäden beteiligt ist.In einem weiteren Schwerpunkt der Arbeit wurde untersucht, ob Unterschiede im Steady-State-Level in Abhängigkeit von Organ-, Gewebe- und Zelltyp auftreten. Dazu wurden Untersuchungen in Bronchialkarzinom-Zellinien verschiedener Subtypen durchgeführt. Des weiteren wurde zur Frage der Zelltyp-Abhängigkeit in der menschlichen Zellinie HL60 der Einfluß des Zelldifferenzierungsstadiums auf die Steady-State-Level untersucht.
Reactive oxygen species (ROS) - e. g. hydroxyl radicals, superoxide radicals, hydrogen peroxide and singlet oxygen - are generated as byproducts of aerobic cellular metabolism. ROS are a threat for the integrity of the genome of every cell. As ROS generate, among other things, oxidative base modifications in DNA - probably in the main 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG), which is highly mutagenic.In this paper the influence of several endogenous factors should be shown on: firstly the steady-state levels of oxidative DNA damage in mammalian cells, secondly the repair rate of this kind of DNA damage.In the hub of this paper stood the characterization of the mammalian 8-oxoG specific glycosylase. This glycosylase is the product of the OGG1 gene, which was cloned firstly in 1997. Cell lines were stably transfected to overexpress the human OGG1 gene (hOGG1). The repair rate of induced oxidative base modifications in the transfectants was up to 3-fold more rapid when compared to the control cells. Furthermore the correlation of gene overexpression with the repair rate was shown. On the other hand the steady-state level of oxidative DNA damage was not influenced by the overexpression. Both, the spontaneous mutation rate and the induced mutagenicity by oxidizing agents, were not reduced due to the hOGG1 overexpression.Further investigations with regard to the importance of the Ogg1 protein were made in cells of homozygous ogg1-/- null mice. In ogg1-/- null cells could be demonstrated, that compared to the OGG1+/+ wildtype cells the repair of induced oxidative base damage is significantly slower. The steady-state level of oxidative DNA damage in ogg1-/- null cells increased in immortalized, fast proliferating fibroblasts about the factor 1.4 and in primary hepatocytes about 2.5 compared to the respective wildtype cells.In addition to this investigations in the XRCC1(X-ray repair cross complementing group 1)-deficient EM9 cells were done. So should be revealed, how far the human enzyme Xrcc1 has a share in the repair of oxidative DNA modifications and if there is an interaction between Xrcc1 and Ogg1. It was demonstrated, that neither the steady-state level nor the repair rate of oxidative base modifications was influenced by the deficiency of XRCC1. But as far as this results have shown, it cannot be excluded, that Xrcc1 protein takes part at least in strand ligation during the repair of oxidatively damaged bases.Another main aspect of this paper was to investigate, if there exist any specific differences in steady-state levels depending on organ-, tissue- or celltype. Therefore the steady-state levels of different subtypes of several lung cancer cell lines were determined. Furthermore the influence of the cell differentiation stage in the human cell line HL60 on the steady-state level was researched.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-1396
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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