Zelluläre Modelle für die direkte Analyse der Aktivität tumorrelevanter Signalwege
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Der MAPK-Signalweg spielt eine zentrale Rolle in der Zellproliferation. Die Signaltransduktionskette reguliert Rezeptorsignale von der äußeren Zellmembran zum Zellkern, wo schließlich die Genexpression durch signalwegaktivierte Transkriptionsfaktoren reguliert wird. Mutationen in diesem Signalweg führen zu unkontrollierter Proliferation und sind in vielen Tumoren zu finden. Mutiertes Ras-Protein, welches die aktivierte Form, Ras-GTP, stabilisiert, führt zu kontinuierlicher Stimulation des Signalweges und damit zu unkontrolliertem Zellwachstum und ist in 30 % aller Tumoren zu finden. Um möglichst schnell potentielle, neue Medikamente zur Krebstherapie zu finden, ist es daher sinnvoll, diesen Signalweg in Zellen zu visualisieren. Deshalb wurde in dieser Arbeit ein fluoreszenzbasierter Zellassay entwickelt, welcher die Aktivität des Ras/Raf-Signalwegs direkt detektieren kann. Hierzu wurden Transfektionsvektoren erstellt, in denen die CRAF-cDNA mit dem Gen für EGFP bzw. mCherry gekoppelt wurde. Durch Transfektion von MDCK und MDCK-F3 Zellen mit den erstellten c-Raf-Fluorophor-Konstrukten konnten mehrere, stabil exprimierende Klone selektiert und kultiviert werden. Nach Charakterisierung dieser Zellklone, wurden die jeweils am besten geeigneten für fluoreszenzmikroskopische Aktivierungs- bzw. Inhibierungsversuche verwendet. Die Fusion eines Fluoreszenzproteins an das Ras-Effektorprotein c-Raf verhilft somit zur direkten mikroskopischen Detektion eines aktivierten Ras/Raf-Signalwegs in Zellen. Dieses Detektionssystem kann in Zukunft zur Wirkstofffindung beitragen.
Auch der Wnt-Signalweg, welcher in vielen unterschiedlichen zellulären Prozessen wie Differenzierung, Proliferation und Apoptose involviert ist, kann bei Fehlregulation zur Tumorentstehung führen. Daher wurde die prinzipielle Möglichkeit der Herstellung einer sowohl Raf/Ras- als auch Wnt-Signalwegaktivität anzeigenden Doppeltransfektanten verifiziert. Des Weiteren wurde herausgefunden, dass Proliferationsergebnisse von BrdU und MTT-Assays in Wnt-3a-stimulierten HEK293T-Zellen wenig vergleichbar sind. Die Differenzen der beiden Proliferationsassays lassen sich durch die unterschiedlichen Anwendungspunkte erklären, nämlich einerseits die mitochondriale Aktivität (MTT) und andererseits die Synthese von DNA (BrdU). Um endgültige Beweise für die zelluläre Proliferationsrate zu bekommen, könnte die Interpretation der Ergebnisse einer einzigen Methode irreführend sein. In Anbetracht dessen ist es zu empfehlen stets mehrere Methoden zu verwenden.