Regulation der Aktivität von Ovastacin, einer Protease aus den cortikalen Granula der Säugereizelle
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Ovastacin ist eine Astacin-Metalloproteinase, die in den cortikalen Granula der Säugeroozyte lokalisiert ist. Während der Fertilisation, nach der erfolgten Verschmelzung des Spermiumkopfes mit dem Oolemma, wird Ovastacin in den perivitellinen Raum exozytiert. Es greift dabei das Zona pellucida Protein 2 (ZP2) enzymatisch an. Durch die Spaltung von ZP2 an einer konservierten Stelle wird die gesamte Struktur der Zona pellucida verändert. Sie härtet aus, wodurch das Vordringen weiterer Spermien zur Oozyte verhindert wird. Dies wird gegenwärtig als Grundlage für den endgültigen Polyspermieblock angesehen. Die negative Regulation der katalytischen Aktivität des Ovastacins während der Oozytenreifung und somit die Verhinderung der vorzeitigen Aushärtung der Zona pellucida wird durch das Plasmaprotein Fetuin-B gewährleistet. Fetuin-B gehört zu den Typ-3 Cystatinen. Das ausbalancierte Zusammenspiel von Ovastacin und Fetuin-B ist für das Entstehen des neuen Lebens eines der Schlüsselereignisse.
Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der Regulation des Ovastacins, von seiner proteolytischen Aktivierung bis hin zu seiner Inhibition durch Fetuin-B. Es gelang, mit der Serinproteinase Plasmin einen in vitro Aktivator für das Pro-Ovastacin zu finden, der auch in vivo relevant sein könnte. Ein effizientes Aktivierungsprotokoll wurde erarbeitet. Mit Hilfe eines synthetischen fluorogenen Substrates und zahlreichen biochemischen Methoden erfolgte die weitgehende Charakterisierung des aktiven Ovastacins. Das Molekulargewicht und der Aminoterminus des reifen Ovastacins (ca. 28 kDa, LLSV), sein pH-Aktivitätsoptimum (pH 8,2) und die Zusammensetzung des geeigneten Arbeitspuffers wurden bestimmt. Es wurde gezeigt, dass Fetuin-B und nicht sein Paralogon Fetuin-A als endogener Hemmstoff von Ovastacin fungiert. Für die Inhibition des Ovastacins durch Fetuin-B wurde eine IC50 von 18 nM bestimmt. Experimente mit zahlreichen Serin-, Cystein-, Aspartat- und Metalloproteinasen legen nahe, dass Fetuin-B ausschließlich Astacin-Metalloproteinasen hemmt. Fetuin-A erwies sich gegenüber den getesteten Proteasen im Gegensatz dazu als nicht inhibitorisch aktiv. In silico Untersuchungen von Fetuin-B mit dem Ziel, die inhibitorisch aktive Einheit des Proteins zu identifizieren, wiesen auf eine besondere Rolle der ersten Haarnadelstruktur innerhalb der zweiten Cystatin-ähnlichen Domäne hervor. Der Austausch dieser Sequenz gegen die entsprechende Region aus der ersten Cystatin-ähnlichen Domäne änderte jedoch nichts an der Hemmfunktion. Auch der Austausch der Cystatin-ähnlichen Domänen zwischen Fetuin-B und Fetuin-A bestätigte lediglich die Tatsache, dass nur komplettes Fetuin-B ein effizienter Hemmstoff für viele Astacinproteinasen ist.