Authors:	Karmilin, Konstantin
Title:	Regulation der Aktivität von Ovastacin, einer Protease aus den cortikalen Granula der Säugereizelle
Online publication date:	8-Nov-2017
Year of first publication:	2017
Language:	german
Abstract:	Ovastacin ist eine Astacin-Metalloproteinase, die in den cortikalen Granula der Säugeroozyte lokalisiert ist. Während der Fertilisation, nach der erfolgten Verschmelzung des Spermiumkopfes mit dem Oolemma, wird Ovastacin in den perivitellinen Raum exozytiert. Es greift dabei das Zona pellucida Protein 2 (ZP2) enzymatisch an. Durch die Spaltung von ZP2 an einer konservierten Stelle wird die gesamte Struktur der Zona pellucida verändert. Sie härtet aus, wodurch das Vordringen weiterer Spermien zur Oozyte verhindert wird. Dies wird gegenwärtig als Grundlage für den endgültigen Polyspermieblock angesehen. Die negative Regulation der katalytischen Aktivität des Ovastacins während der Oozytenreifung und somit die Verhinderung der vorzeitigen Aushärtung der Zona pellucida wird durch das Plasmaprotein Fetuin-B gewährleistet. Fetuin-B gehört zu den Typ-3 Cystatinen. Das ausbalancierte Zusammenspiel von Ovastacin und Fetuin-B ist für das Entstehen des neuen Lebens eines der Schlüsselereignisse. Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der Regulation des Ovastacins, von seiner proteolytischen Aktivierung bis hin zu seiner Inhibition durch Fetuin-B. Es gelang, mit der Serinproteinase Plasmin einen in vitro Aktivator für das Pro-Ovastacin zu finden, der auch in vivo relevant sein könnte. Ein effizientes Aktivierungsprotokoll wurde erarbeitet. Mit Hilfe eines synthetischen fluorogenen Substrates und zahlreichen biochemischen Methoden erfolgte die weitgehende Charakterisierung des aktiven Ovastacins. Das Molekulargewicht und der Aminoterminus des reifen Ovastacins (ca. 28 kDa, LLSV), sein pH-Aktivitätsoptimum (pH 8,2) und die Zusammensetzung des geeigneten Arbeitspuffers wurden bestimmt. Es wurde gezeigt, dass Fetuin-B und nicht sein Paralogon Fetuin-A als endogener Hemmstoff von Ovastacin fungiert. Für die Inhibition des Ovastacins durch Fetuin-B wurde eine IC50 von 18 nM bestimmt. Experimente mit zahlreichen Serin-, Cystein-, Aspartat- und Metalloproteinasen legen nahe, dass Fetuin-B ausschließlich Astacin-Metalloproteinasen hemmt. Fetuin-A erwies sich gegenüber den getesteten Proteasen im Gegensatz dazu als nicht inhibitorisch aktiv. In silico Untersuchungen von Fetuin-B mit dem Ziel, die inhibitorisch aktive Einheit des Proteins zu identifizieren, wiesen auf eine besondere Rolle der ersten Haarnadelstruktur innerhalb der zweiten Cystatin-ähnlichen Domäne hervor. Der Austausch dieser Sequenz gegen die entsprechende Region aus der ersten Cystatin-ähnlichen Domäne änderte jedoch nichts an der Hemmfunktion. Auch der Austausch der Cystatin-ähnlichen Domänen zwischen Fetuin-B und Fetuin-A bestätigte lediglich die Tatsache, dass nur komplettes Fetuin-B ein effizienter Hemmstoff für viele Astacinproteinasen ist. Ovastacin is an astacin metalloproteinase localized in cortical granules within the mammalian oocyte. During fertilization, after the successful invasion of the spermatozoon into the oocyte, ovastacin is released into the perivitelline space. There it cleaves the zona pellucida protein 2 (ZP2) enzymatically. By cleavage of ZP2 at a conserved site, the conformation of the zona pellucida changes. It hardens to prevent the docking of further sperm to the oocyte. This is presently considered to be the basis for the final block of polyspermy. The negative regulation of the catalytic activity of ovastacin during oocyte maturation and so the prevention of premature hardening of the zona pellucida is ensured by the plasma protein fetuin-B. Fetuin-B is type-3 cystatin. The balanced interplay of ovastacin and fetuin-B is one of the key events for the emergence of new life. The aim of this study was to elucidate the regulation of ovastacin, from its proteolytically activation to its inhibition by fetuin-B. The serine proteinase plasmin was shown to act as an in vitro activator of pro-ovastacin, which might be also relevant in vivo. An efficient activation protocol was developed. Using of a synthetic fluorogenic substrate and numerous biochemical methods allowed the extensive characterization of the active ovastacin. The molecular weight (28 kDa), the amino terminus of the mature ovastacin (LLSV), its activity pH-optimum (pH 8.2) and the composition of an appropriate working buffer were determined. It was shown that fetuin-B and not its paralogon fetuin-A acts as an endogenous inhibitor of ovastacin. For the inhibition of ovastacin by fetuin-B an IC50 of 18 nM was determined. Experiments with several serine-, cysteine-, aspartic- and metalloproteinases suggest that fetuin-B inhibits only astacin metalloproteinases. In contrast, fetuin-A does not show against the tested proteases inhibitory activity. In silico analysis of fetuin-B with the aim to identify the inhibitorily active unit of the protein, suggested a special role of the first hairpin-loop structure within the second cystatin-like domain. However, the exchange of this sequence for the corresponding region of the first cystatin-like domain did not alter the inhibitory function. The reshuffling of the cystatin-like domains between fetuin-A and fetuin B confirmed the fact that only complete fetuin-B is an efficient inhibitor for astacin proteinases.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1366
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000016423
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	XVI, 127 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen