Authors:	Glaffig, Markus
Title:	Entwicklung und immunologische Auswertung synthetischer Antitumor-Impfstoffe auf Basis der tumorassoziierten Formen des Glycoproteins MUC1
Online publication date:	2-Nov-2017
Year of first publication:	2017
Language:	german
Abstract:	Eine Aktivimmunisierung durch Antitumor-Vakzine ist ein vielversprechender Ansatz im Kampf gegen Krebs. Ziel dieser Arbeit war daher die Synthese und die immunologische Evaluierung von Antitumor-Impfstoffen, die auf antigenen Strukturen des tumorassoziierten Glycoproteins MUC1 basieren. Grundlage für ihre Entwicklung ist, dass das Immunsystem die normale Form des Mucins MUC1 auf gesundem Gewebe von dessen tumorassoziierter Form, wie sie als Folge veränderter Genexpressionen auf Krebszellen vorkommt, unterscheidet. In dieser Arbeit wurden Antitumor-Vakzine mit strukturell definierten MUC1-Glycopeptid-Antigenen durch gezielte chemische Synthese hergestellt, die möglichst genau den tumorassoziierten Strukturen der Tumorzelloberfläche ähneln und dadurch eine selektiv gegen das Krebsgewebe gerichtete Immunantwort auslösen sollten. Als gemeinsame Basis für den Aufbau aller Krebs-Vakzine galt eine 22 Aminosäure umfassende Partialsequenz des epithelialen MUC1-Glycoproteins. Der Aufbau jedes einzelnen MUC1-Glycopeptids gelang durch Festphasenpeptidsynthese (SPPS). Hierfür waren mehrstufige Synthesen von verschiedenen tumorassoziierten Kohlenhydrat-Antigenen, d.h. Glycosylaminosäuren, sowie immunologisch inerte Verbindungsmoleküle als Fmoc-blockierte SPPS-Bausteine erforderlich, die anschließend in die Sequenz von MUC1-Glycopeptiden eingebaut wurden. Die Reinigung der synthetisierten Glycopeptide gelang durch semipräp. HPLC, wobei die Strukturen sowie die hohe Reinheit stets durch analytische HPLC, hochauflösende Massenspektrometrie sowie durch 2D-NMR belegt wurden. Um die geringe Immunogenität von solchen körpereigenen MUC1-Glycopeptiden zu erhöhen, wurden sie an Immunstimulanzien, wie das immunogene Protein Tetanus-Toxoid, gebunden. Die Weiterentwicklung des bestehenden MUC1-Glycopeptid-Vakzin-Konzepts zu Impfstoffen, die zu einer Verstärkung der Immunantwort führen sollten, gelang auf verschiedenen Wegen: Durch Veränderungen im Aufbau, etwa durch multiple Präsentation der MUC1-Antigene, durch Verwendung zusätzlicher Adjuvantien und durch gezielte Adressierung bestimmter Immunzellen mittels Mannose-Liganden. Um das immunologische Potential dieser unterschiedlichen, synthetischen Antitumor-Impfstoffe zu bewerten, wurden sie in interdisziplinärer Kooperation in präklinischen Studien immunologisch evaluiert. Alle Impfstoffe lieferten in Immunisierungsstudien an Mäusen durchweg hohe Immunantworten mit der Induktion selektiver Antikörper, die in der Lage waren, an humane Tumorzellen zu binden. Letztlich wurde neben der chemischen Weiterentwicklung der Antitumor-Impfstoffe durch neue Immunisierungsstudien an genetisch veränderten Mäusen, die zur Expression von humanem MUC1 befähigt sind, untersucht, ob solche Antitumor-Vakzine beim Menschen wirken können, d.h. in Systemen, in denen humanes MUC1 ein Selbst-Antigen darstellt, das normalerweise durch Selbsttoleranz des Immunsystems geschützt wird. An active immunization by anti-tumor vaccines is a promising approach to fight cancer. Therefore, the aim of this work was the synthesis and immunological evaluation of anti-tumor vaccines based on antigenic structures of the tumor-associated glycoprotein MUC1. The basis for their development is that the immune system distinguishes the normal form of the mucin MUC1 on healthy tissue from its tumor-associated form, as it occurs as a result of altered gene expression on cancer cells. In this work, anti-tumor vaccines with structurally defined MUC1-glycopeptide antigens were prepared by chemical synthesis, which were as close as possible to the tumor-associated structures of the tumor cell surface and thus trigger a selective immune response against the cancer tissue. A partial sequence of the epithelial MUC1-glycoprotein, comprising 22 amino acids, was used as a common basis for the construction of all cancer vaccines. The structure of each individual MUC1-glycopeptide was achieved by solid phase peptide synthesis (SPPS). For this purpose, multi-step syntheses of different tumor-associated carbohydrate antigens, i. e. glycosylated amino acids as well as immunologically inert spacers, as Fmoc-protected SPPS building blocks were required, which were subsequently incorporated into the sequence of MUC1-glycopeptides. The purification of the synthesized glycopeptides was achieved by semiprep. HPLC, the structures and the high purity were confirmed by analytical HPLC, high-resolution mass spectrometry and 2D NMR. In order to increase the low immunogenicity of such endogenous MUC1-glycopeptides, they were bound to immunostimulants, such as the immunogenic protein tetanus toxoid. The further development of the existing MUC1-glycopeptide vaccine concept to vaccines, which should lead to an amplification of the immune response, was achieved in several ways: by changes in the structure, for example by multiple presentation of the MUC1 antigens, by using additional adjuvants and by targeting of certain immune cells by means of mannose ligands. In order to evaluate the immunologic potential of these different synthetic antitumor vaccines, they were immunologically tested in interdisciplinary cooperation in preclinical studies. All vaccines provided consistently high immunological responses in mice immunization studies with the induction of selective antibodies that were able to bind to human tumor cells. Finally, in addition to the chemical development of the anti-tumor vaccines, new immunization studies on genetically modified mice capable of expressing human MUC1 have been conducted to investigate whether such anti-tumor vaccines can function in humans, in systems where human MUC1 is a self-antigen usually protected by self-tolerance of the immune system.
DDC:	540 Chemie 540 Chemistry and allied sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1360
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000016367
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	256 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen