Authors:	Böse, Thomas
Title:	Stimulation of angiogenesis and osteogenesis in a dynamic co-culture model of bone tissue engineering
Online publication date:	1-Nov-2017
Year of first publication:	2017
Language:	english
Abstract:	The development of a successful strategy for the generation of bone tissue engineering constructs in vitro is highly dependent on the integration of a complex vascular system. For this purpose, co-cultures (CC) of stromal cells with endothelial cells (EC) have been developed and evaluated in order to stimulate the formation of vessel-like structures (VLS) ex vivo. In this context, the time for in vitro processing aiming at tissue formation has to be optimized according to the overall time span and maximum therapeutic outcome of the chosen strategy. Furthermore, the application of state-of-the-art technologies such as perfusion bioreactors can additionally support the cells within a generated construct. Therefore, the present study aimed at developing a cultivation strategy that permits the generation of prevascularized osteogenic CC samples in vitro. An initial evaluation of osteogenesis in mesenchymal stem cell mono-cultures (MSC MC) found a cell seeding density (CSD) of 20,000 MSC/cm2 to result in the highest degree of osteogenic differentiation. When evaluating osteogenesis in MSC MCs on 3D trabecular nickel-titanium alloy (tNiTi) scaffolds in a perfusion bioreactor it was found that medium perfusion supports the osteogenic differentiation of MSC. In contrast, medium perfusion as sole stimulus was not sufficient to induce osteogenesis in human MSC. These results represent a starting point for the evaluation of a CC system of MSC with EC under comparable dynamic conditions. However, primary EC are limited in their angiogenic activity and total available numbers upon expansion in vitro. Therefore, strategies focusing on the stimulation of osteogenesis and VLS formation in a common CC system were initially performed in 2D. This should allow for an initial screening, the adequate optimization and evaluation of individual factors of the culture system, as well as the determination of their respective impact. The initial evaluation of the cell seeding ration (CSR) in CC of MSC with human dermal microvascular EC (HDMEC) demonstrated a remarkable effect on the formation of VLS. VLS formation was found to reach a maximum when a CSR of 3:2 (MSC:HDMEC) was combined with a MSC CSD of 20,000 MSC/cm2. Interestingly, this CSD also resulted in maximum osteogenesis in MSC MCs. The following screening studies aimed at examining the combination of proosteogenic and pro-angiogenic factors in order to simultaneously stimulate osteogenesis and VLS formation in the CC system. The results clearly indicated that osteogenic supplements (OS) suppress VLS formation while pro-angiogenic supplements (HF, heparin+bFGF) suppress osteogenic differentiation by the incorporated MSC fraction. The interaction between OS and HF indicated that a sequential strategy involving separate stimulation of osteogenesis in MSC and the formation of VLS might be superior to a simultaneous stimulation strategy. For this purpose, two sequential strategies were evaluated. In a first strategy MSC MCs were primed in osteogenic differentiation medium (ODM) to induce osteogenic differentiation and subsequently evaluated for their capacity to induce VLS formation in a CC with EC. The results clearly demonstrated that osteogenic priming of MSC in ODM reduced their potential to induce the formation of VLS in CC with EC, most likely due to the dexamethasone (Dex)-mediated reduction of VEGF expression by the MSC. The observed effects were found to be independent of the initial number of MSC present in the CC or of osteogenic matrix that was formed during the osteogenic priming process. However, since VEGF expression is required for the induction of VLS formation in vitro a second sequential cultivation strategy focused on the induction of VLS formation before osteogenesis by the incorporated MSC fraction was stimulated. This approach reliably resulted in the generation of CC samples that contained pre-formed vascular networks embedded within an osteogenic matrix. Analysis of other factors produced in the model indicated that inhibition effects on the VLS formation were found upon exogeneous phosphorus supplementation and that this could be reversed by re-switching the CC to a proangiogenic medium. At the same time, the formation of osteogenic matrix could be maintained. Furthermore, the results showed that the observed rapid osteogenic differentiation of MSC within prevascularized CC is dependent on the presence of but independent of the type of EC. Similarly, the rapid osteogenic induction could be obtained when exchanging bone marrow-derived MSC (bmMSC) with adipose tissuederived MSC (atMSC). Nevertheless, by varying the type of ODM it could be demonstrated that the outcome of the second sequential cultivation strategy does not represent an artifact induced as a response to a specific differentiation medium. Altogether, the present study established a reproducible strategy for the generation of a prevascularized CC containing an osteogenic matrix within a well-defined time frame of less than 14d. At the same time, the evaluation of the opposite sequential strategy or the simulateous stimulation strategy revealed reducing or inhibitory effects of medium components on either vascularization and angiogenesis or osteogenesis. Together with the findings of enhanced osteogenesis in MSC MCs on 3D scaffolds by medium perfusion the present study defined conditions applicable for the transfer of the promising sequential cultivation strategy into a 3D dynamic environment. Die Entwicklung einer erfolgreichen Strategie zur Erzeugung von Konstrukten für das Tissue Engineering von Knochengewebe in vitro ist stark abhängig von der Integration eines komplexen Gefäßsystems. Zu diesem Zweck wurden Co-Kulturen von Stromazellen mit Endothelzellen etabliert und evaluiert, mit dem Ziel, die Bildung von VLS ex vivo zu stimulieren. In diesem Zusammenhang ist die Zeit für die in vitro- Bearbeitung, mit dem Ziel der Gewebebildung, hinsichtlich der Gesamtzeitspanne und maximalem therapeutischen Ergebnis der jeweiligen Strategie zu optimieren. Zusätzlich kann die Anwendung von state-of-the-art-Technologien wie Perfusionsbioreaktoren die Zellen innerhalb eines erzeugten Konstrukts unterstützen. Ziel der vorliegenden Studie war die Entwicklung einer Kultivierungsstrategie, welche die Erzeugung von prevaskularisierten und osteogen differenzierten Co-Kulturproben in vitro ermöglicht. Eine erste Untersuchung der Osteogenese in MSC Mono-Kulturen identifizierte den höchsten Grad der osteogenen Differenzierung bei Verwendung einer CSD von 20.000 MSC/cm2 Eine Evaluierung der Osteogenese in MSC Mono-Kulturen auf 3D tNiTi Scaffolds in einem Perfusionsbioreaktor bewies, daß Mediumperfusion die osteogene Differenzierung von MSC unterstützt. Im Gegensatz dazu war die Mediumperfusion als alleiniger Stimulus nicht ausreichend, um die Osteogenese in menschlichen MSC zu induzieren. Diese Ergebnisse repräsentieren einen Ausgangspunkt für die Bewertung eines Co-Kultursystems von MSC mit Endothelzellen unter vergleichbaren dynamischen Bedingungen. Jedoch sind primäre Endothelzellen in ihrer angiogenen Aktivität und verfügbaren totalen Zellzahl durch die Expansion in vitro begrenzt. Um einzelne Einflussfaktoren adäquat bewerten und optimieren sowie Ihre jeweiligen Auswirkungen bestimmen zu können, wurden aus diesem Grund die Strategien, die sich auf die Stimulation der Osteogenese und Gefäßbildung in einem gemeinsamen Co-Kultursystem konzentierten, anfänglich in 2D durchgeführt. So ergab ein erste Untersuchung zum Einfluss des MSC:HDMEC CSR einen deutlichen Einfluss auf die Bildung von VLS. Eine maximale VLS Bildung resultierte aus der Anwendung eines CSR von 3: 2 (MSC:HDMEC) verbunden mit einer anfänglichen MSC CSD von 20.000 MSC/cm2. Die gleiche MSC CSD ergab auch eine maximale Induktion der Osteogenesis in MSC Mono-Kulturen. Eine aufbauende Screening-Studie hatte im Folgenden das Ziel, die Kombination von pro-osteogenen (OS) und pro-angiogenen Faktoren (HF) in einem Zellkulturmedium zu untersuchen. Das Ziel bestand in der gleichzeitigen Stimulation der Osteogenese in MSC und der Bildung von VLS im Co-Kultursystem. Die Ergebnisse zeigten deutlich, dass die Zugabe von OS die VLS Bildung unterdrückte, während die Supplementierung von HF die osteogene Differenzierung der MSC-Fraktion verhinderte. Die Wechselwirkung zwischen OS und HF deutete zudem darauf hin, dass eine sequenzielle Mediumstrategie zur separaten Stimulation der Osteogenese in MSC und der Bildung von VLS möglicherweise vorteilhafter ist. Hierzu wurden zwei aufeinanderfolgende Strategien untersucht. In einer ersten Strategie wurden MSC Mono-Kulturen zur Stimulation der osteogenen Differenzierung in ODM vorkultiviert und anschließend hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Stimulation der VLSBildung in einer Co-Kultur mit Endothelzellen evaluiert. Die Ergebnisse zeigten deutlich, dass die osteogene Vorstimulation von MSC in ODM deren Potential zur Stimulation der VLS Bildung in einer Co-Kultur mit Endothelzellen reduziert. Dieser Effekt kann möglicherweise auf eine Dex-vermittelte Reduktion der VEGFExpression seitens der MSC zurückgeführt werden. Die Resultate waren in diesem Zusammenhang unabhängig sowohl von der initialen Anzahl der MSC in der Co- Kultur als auch von osteogener Matrix, die während der osteogenen Vorstimulation der MSC in ODM gebildet wurde. Da die Expression von VEGF jedoch für die Induktion der VLS-Bildung in vitro essentiell ist, zielte eine alternative zweite sequentielle Kultivierungsstrategie darauf ab, zuerst die Bildung von VLS in der Co- Kultur zu stimulieren und anschließend die osteogene Differenzierung der beinhalteten MSC-Fraktion zu induzieren. Dieser Ansatz ermöglichte die reproduzierbare Generierung von Co-Kulturen, die vorgeformte Gefäßnetzwerke eingebettet in einer osteogenen Matrix enthalten. Eine Analyse weiterer Einflussfaktoren im Modell ergab, dass eine hemmende Wirkung durch exogen supplementiertes Phosphat auf die VLS-Bildung durch eine wiederholte Umstellung der Co-Kultur auf ein pro-angiogenes Medium umgekehrt werden konnte. Gleichzeitig konnte die Ausbildung einer osteogenen Matrix aufrechterhalten werden. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse, dass die beobachtete rasche osteogene Differenzierung der MSC innerhalb der prevaskularisierten Co-Kultur abhängig von der Anwesenheit, jedoch unabhängig von der Art der verwendeten Endothelzellen ist. Des Weiteren konnte die schnelle Induktion der Osteogenese neben bmMSC auch in atMSC erzielt werden.Zusätzlich konnte durch Variation der Zusammensetzung des ODM gezeigt werden, dass das reproduzierbare Ergebnis der zweiten sequentiellen Kultivierungsstrategie kein Artefakt als Antwort auf ein spezifisches Differenzierungsmedium repräsentiert. Zusammengefasst hat die vorliegende Studie eine reproduzierbare Kultivierungsstrategie etabliert, mit der in weniger als 14d Co-Kulturproben generiert werden können, welche vorgeformte Gefäßstrukturen eingebettet in eine osteogene Matrix enthalten. Zugleich wies die Auswertung der gegenübergestellten ersten sequentiellen Kultivierungsstrategie oder der simultanen Stimulationsstrategie eine reduzierende oder hemmende Wirkung einzelner Mediumkomponenten sowohl auf die Vaskularisierung und Angiogenese als auch auf die Osteogenese in MSC nach. Zusammen mit den Ergebnissen der verstärkten Osteogenese in MSC Mono- Kulturen auf 3D-Scaffolds durch Mediumperfusion hat die vorliegende Studie klare Rahmenbedingungen für die Maßstabsübertragung einer vielversprechenden sequentiellen Kultivierungsstrategie in eine dynamische 3D-Umgebung definiert.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1357
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000016335
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	189 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen