Authors:	Herr, Uta-Mareike
Title:	Expression und Prozessierung von APP cis-Dimeren in Abhängigkeit von LRP1
Online publication date:	25-Oct-2017
Year of first publication:	2017
Language:	german
Abstract:	Viele Studien zum Amyloid-Vorläuferprotein (APP) beschäftigten sich, aufgrund der Möglichkeit zur Generierung von Aβ-Peptiden, mit dessen Beteiligung an der Pathogenese der Alzheimer Krankheit. Dabei konnte festgestellt werden, dass APP unter normalen physiologischen Bedingungen hauptsächlich auf zwei Wegen prozessiert wird. So erfolgt neben der vorwiegend ablaufenden, enzymatischen Spaltung von APP durch ADAM10 auf dem nicht-amyloidogenen Weg auch die Bildung von Aβ-Peptiden durch Prozessierung entlang des amyloidogenen Weges. Letzterer wird wohl hauptsächlich durch die Aktivität von BACE1 eingeleitet, wobei vor Kurzem Meprin β ebenfalls als Sekretase zur Produktion von Aβ-Peptiden identifiziert wurde. Im Zusammenhang mit der Generierung von Aβ-Peptiden wurde schon früh eine Beteiligung des Rezeptors LRP1 festgestellt. Mehrere Studien haben gezeigt, dass dieser über direkte oder indirekte Interaktionen mit APP vermutlich die gemeinsame Endozytose der Proteine von der Zelloberfläche vermittelt, sodass APP der amyloidogenen Prozessierung durch BACE1 in endosomalen Zellkompartimenten zugeführt werden kann. Neben anderen Proteinen scheint auch der Oligomerisierungszustand von APP Einfluss auf dessen enzymatischen Spaltung durch die α-, β- und γ-Sekretasen zu haben. Da ein großer Teil des synthetisierten APP wohl in dimerisierter Form vorliegt und sogar in vivo in Gehirnen von Mäusen nachweisbar war, wurde bereits in mehreren Studien der Zusammenhang zwischen der APP-Dimerisierung und der Bildung von Aβ-Peptiden diskutiert. Die Untersuchungen ergaben jedoch kontroverse Ergebnisse, was wohl zumindest teilweise auf die verwendeten APP-Konstrukte zur Expression von APP-Dimeren zurückzuführen war. Um die Expression und Prozessierung von dimerisierten APP-Proteinen sowie die Beteiligung von LRP1 an diesen Vorgängen weiter zu untersuchen, wurde in dieser Arbeit zunächst ein Expressions-Konstrukt generiert, das zu APP-Proteinen führte, die bevorzugt dimerisierten. Die Expression dieser APP Cys-Mutante (APP695 K587C) resultierte in der Bildung Hitze-stabiler APP-Dimere und wurde für die stabile Transfektion von CHO-Zellen genutzt. Durch Untersuchungen von LRP1-defizienten CHO 13-5-1-Zellen sowie von kortikalen Primärneuronen mit induziertem Lrp1-Knockout konnte eine deutliche Steigerung der Prozessierung nicht nur des monomeren, sondern besonders auch des dimeren APP festgestellt werden. Die Pulse-Chase-Analyse von CHO-Zellen mit stabiler APP695 K587C-Expression deutet darauf hin, dass LRP1 den Transport von APP-Dimeren zur Zelloberfläche beeinträchtigt und so dessen Prozessierung beeinflusst. Weiterhin scheint LRP1 auch in die Internalisierung von APP-Dimeren involviert zu sein. Folglich bewirkt die LRP1-Defizienz vermutlich eine Stabilisierung der dimerisierten APP-Proteine an der Zelloberfläche und somit deren gesteigerte Spaltung durch dort aktive Sekretasen. An diesem Vorgang könnten sowohl ADAM10, als auch Meprin β beteiligt sein, da für beide Sekretasen eine Aktivität an dimerisierten APP-Molekülen gezeigt wurde. Für Meprin β wird sogar eine Favorisierung von APP-Dimeren gegenüber –Monomeren vermutet, was eventuell auf kooperative Effekte aufgrund der Dimerisierung von APP zurückzuführen ist. Sowohl ein beschleunigter Transport zur Zelloberfläche, als auch eine verminderte Internalisierung von APP könnten die signifikante Zunahme insbesondere an sAPP-Fragmenten in der CSF von Mäusen mit Lrp1-Knockout erklären. Allerdings geben diese in vivo-Daten durch den besonders starken Effekt der fehlenden LRP1-Expression auf die sAPP-Dimer-Bildung zudem Anlass zur Annahme, dass LRP1 nicht nur die Prozessierung, sondern auch die Bildung von APP-Dimeren beeinflusst. Aufgrund der ähnlichen Eigenschaften der in dieser Arbeit analysierten APP cis-Dimere zum monomeren APP in Bezug auf Transport, Internalisierung und Prozessierung könnten APP-Dimere, wie monomeres APP, verschiedene physiologische und pathologische Funktionen von APP regulieren. Dabei deuten die hier dargestellten Ergebnisse zudem auf eine entscheidende Rolle von LRP1 hin. Many studies of the amyloid precursor protein (APP) focused on its involvement in the pathogenesis of Alzheimer’s disease due to its ability to generate Aβ peptides. Though, APP was shown to be processed mainly on two pathways under physiological conditions. In contrast to the predominant cleavage by ADAM10 during the non-amyloidogenic pathway, processing of APP by the amyloidogenic pathway results in the production of Aβ peptides. This is mainly based on BACE1 activity but can also be performed by meprin β, a secretase that has recently been identified to generate N-teminally truncated Aβ variants by cleavage of APP. Due to its direct or indirect interaction with APP the receptor protein LRP1 has been assumed to participate in the formation of Aβ peptides. Several studies showed that LRP1 expression facilitates Aβ production probably by mediating APP endocytosis from the cell surface, thereby supporting the accessibility of APP for BACE1 cleavage in endosomal compartments. Not only the interaction with LRP1 or other receptors, but also the oligomerisation state of APP itself seems to play a role in APP processing by α-, β- and γ-secretases. Recently it has been shown that a large fraction of APP exists in a dimerised form and that APP dimers also occur in vivo in mouse brains. Thus, several studies already tried to reveal the context between APP dimerization and the generation of Aβ peptides. However, the analyses resulted in controversial results, probably at least in part due to the various constructs used to induce APP dimerisation. To further analyse the expression and the processing of dimerised APP and the involvement of LRP1 in these events, an expression construct for preferential formation of APP dimers was generated. This APP mutant (APP695 K587C) resulted in heat-stable APP dimers and was used to stably transfect CHO K1 and CHO 13-5-1 cells with an APP dimer construct. The investigation of the LRP1-deficient CHO 13-5-1 cells as well as of primary cortical neurons with an induced Lrp1 knockout revealed a significantly increased processing not only of APP monomers but also of APP dimers. A pulse-chase assay of the stably transfected CHO cells indicated that LRP1 may impact the trafficking of APP dimers to the cell surface, thereby affecting their processing. Furthermore, the results of this study point to an impact of LRP1 in endocytosis of APP dimers from the cell surface. Thus, LRP1 deficiency may lead to a 4 stabilisation of dimerised APP and along with this to an increased sAPP dimer generation by secretases active at the cell surface. In this process ADAM10 as well as meprin β may be involved, as for both secretases an activity on APP dimers could be detected. Moreover, meprin β seems to preferentially cleave dimeric compared to monomeric APP, suggesting a cooperative effect of APP dimerisation on meprin β activity. The in vivo data showing a significant increase in sAPP generation in the CSF of mice with an induced Lrp1 knockout may result from a faster trafficking of APP to as well as from a reduced internalisation from the cell surface in absence of LRP1. Nevertheless, the particularly immense gain of soluble APP dimers further points to a role of LRP1 not only in processing but also in formation of APP dimers. The similar characteristics in transport, endocytosis and processing of monomeric APP and the analysed APP cis-dimers in this study indicate that these dimers may also control various physiological and pathological functions of APP. In addition, the here depicted results implicate a crucial role of LRP1 in those processes.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1353
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000016274
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	XII, 120 Blätter
Appears in collections:	JGU-Publikationen