Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-1349
Authors: Solem, Even
Title: Heterologe Expression und physikochemische Charakterisierung der Polyphenoloxidasen aus dem Cabernet Sauvignon (Vitis vinifera)
Online publication date: 19-Oct-2017
Language: german
Abstract: Type-3 copper proteins are ubiquitously distributed. Polyphenol oxidases (PPOs), which are characteristic for green plants, are classified as enzymatic tyrosinases and catechol oxidases. In the present work, three PPO sequences from the grape Vitis vinifera L. cv. Cabernet Sauvignon (L-VvPPOcs-1, L-VvPPOcs-2 and L-VvPPOcs-3) were obtained from cDNA by cloning and sequencing. These were defined as two different isoforms, one of which is presumably represented by two alleles (L-VvPPOcs-1 and L-VvPPOcs-2). Here, L-VvPPOcs-1 had a sequence identity of 98.8 % to that of Virador et al. (2010) published reference structure L-VvPPOg (U83274). In addition, for L-VvPPOcs-2 and L-VvPPOcs-3 a heterologous recombinant expression system in E. coli could be established. This allowed an overexpression of the latent isoenzymes with a molecular mass of about 60 kDa as native strep-tag II fusion proteins, which could be obtained by affinity chromatography with yielded purities of 90-95 %. Subsequently the biochemically enriched latent PPOs were enzymatically characterized after activation with SDS. Using a biochemical assay in native PAGE, the recombinant enzymes were tested for both mono- and diphenolase activities. For L-VvPPOcs-2, the results showed for the first time, a recombinant plant PPO with explicit monophenolase activity. The recombinant L-VvPPOcs-3, on the other hand, also showed clear diphenolase activity, but no significant enzymatic conversion was found for the monophenols used. Thus, L-VvPPOcs-3 was designated as catechol oxidase. Adopting PCR-based site-directed mutagenesis experiments on L-VvPPOcs-3 expression constructs, thereby substituting a glycine to an asparagine, resulted in a full conversion into a tyrosinase with defined monophenolase activity. For type-3 copper proteins, these results show the dependence of the monophenolase activity on the presence of an asparagine and a conserved glutamate, which together bind and activate an also conserved water molecule. The latter most likely mediates the deprotonation of monophenolic substrates, which allows adequate coordination of the formed phenolates to the CuA binding site. The bound phenolates can then be hydroxylated in ortho-position with the corresponding catecholates. The presented results allow the controversially discussed discrimination of catechol oxidases and tyrosinases at the molecular level.
Typ 3-Kupferproteine sind ubiquitär verbreitet. PPOs, die für pflanzliche Systeme charakteristisch sind, werden in enzymatische Tyrosinasen und Catecholoxidasen unterteilt. In der vorliegenden Arbeit wurden ausgehend von cDNA durch Klonierung und Sequenzierung drei PPO-Sequenzen aus der Weinrebe Vitis vinifera L. cv. Cabernet Sauvignon ermittelt (L-VvPPOcs-1, LVvPPOcs-2 und L-VvPPOcs-3). Diese wurden als zwei unterschiedliche Isoformen definiert, wovon eine vermutlich durch zwei Allele repräsentiert wird (L-VvPPOcs-1 und L-VvPPOcs-2). Hierbei wies LVvPPOcs-1 eine Sequenzidentität von 98,8 % zu der von Virador et al. (2010) veröffentlichten Referenzstruktur L-VvPPOg (U83274) auf. Zudem gelang es für L-VvPPOcs-2 und L-VvPPOcs-3 ein heterologes rekombinantes Expressionssytem in E. coli zu etablieren. Dieses erlaubte eine Überexpression der latenten ca. 60 kDa schweren Isoenzyme als Strep-Tag II-Fusionsproteine in nativer Form, welche mittels Affinitäts-chromatographie in einer Reinheit von 90-95 % gewonnen werden konnten. Die biochemisch angereicherten latenten PPOs wurden anschließend nach Aktivierung mit SDS enzymatisch charakterisiert. Mit Hilfe eines biochemischen Assays in nativer PAGE wurden die erhaltenen rekombinanten Enzyme sowohl auf Mono- als auch auf Diphenolase-Aktivitäten getestet. Für L-VvPPOcs-2 zeigten die Ergebnisse zum ersten Mal eine rekombinante pflanzliche PPO mit ausdrücklicher Monophenolase-Aktivität. Das rekombinante L-VvPPOcs-3 hingegen wies zwar ebenfalls eindeutige Diphenolase- Aktivitäten auf, jedoch konnte kein nennenswerter enzymatischer Umsatz für die eingesetzten Monophenole festgestellt werden, was dieses Isoenzym als Catecholoxidase auszeichnet. Ausgehend vom L-VvPPOcs-3-Expressionskonstrukt gelang es mit Hilfe von PCR-basierter ortsgerichteter Mutagenese durch Substitution eines Glycins gegen ein Asparagin das rekombinante L-VvPPOcs-3 in eine Tyrosinase mit definierter Monophenolase-Aktivität zu konvertieren. Für Typ 3-Kupferproteine zeigen diese Ergebnisse die Abhängigkeit der Monophenolase-Aktivität von der Präsenz eines Asparagins und eines konservierten Glutamats, welche gemeinsam ein ebenfalls konserviertes Wassermolekül binden und aktivieren. Letztgenanntes vermittelt höchstwahrscheinlich die Deprotonierung von monophenolischen Substraten, was die adäquate Koordination der gebildeten Phenolate an die CuA-Bindungsstelle ermöglicht. Die gebundenen Phenolate können anschließend in ortho-Stellung zu den korrespondierenden Catecholaten hydroxyliert werden. Die vorgestellten Ergebnisse erlauben die kontrovers diskutierte Unterscheidung von Catecholoxidasen und Tyrosinasen auf molekularer Ebene.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-1349
URN: urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000016042
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: 138 Blätter
Appears in collections:JGU-Publikationen

Files in This Item:
  File Description SizeFormat
Thumbnail
100001604.pdf20.62 MBAdobe PDFView/Open