Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-1337
Authors: Keller, Patrick
Title: Einfluss der Phosphorylierung durch die Casein Kinase II auf den HSP90-Chaperone-Zyklus in humanen Zellen
Online publication date: 3-Apr-2012
Language: german
Abstract: In der vorliegenden Arbeit wurde eine Analysenmethode auf Basis der Massenbestimmung über Elektrospray-Ionisation qualifiziert, mit der es möglich ist, den Gehalt beider in humanen Zellen vorliegenden isoformen Chaperone HSP90-alpha und HSP90-beta sowie deren Phosphorylierungsstatus in der sog. „charged linker“-Region (CLR) getrennt voneinander zu bestimmen. Die Quantifizierung dieser posttranslationalen Modifikation von HSP90 in der noch wenig untersuchten Region des Chaperons stellte eine besondere Herausforderung an das analytische Messsystem dar, da diese sich fast ausschließlich aus geladenen Aminosäuren zusammensetzt und eine hohe Sequenzhomologie der beiden Isoformen in humanen Zellen vorliegt. Mit dieser Methode ist es gelungen, sowohl die stärkere Expression beider Isoformen in Tumor-Zelllinien im Vergleich zu Nicht-Tumor-Zelllinien als auch signifikant höhere Level beider phosphorylierten Varianten in den Tumor-Zelllinien nachzuweisen. Des Weiteren konnte durch gezielte Arretierung der Tumor-Zelllinie HCT116 in der G0/G1-Phase des Zellzyklus der Nachweis erbracht werden, dass nur HSP90-alpha in diesem Ruhestadium der Zellteilung in der phosphorylierten Form vorliegt. rnDa die Phosphorylierung der CLR von HSP90 als ein Marker für die Substrataktivierung herangezogen werden kann, besteht jetzt die Möglichkeit, Auswirkungen von z. B. HSP90-Inhibitoren auf beide HSP90-Isoformen hinsichtlich ihrer Expression und Phosphorylierung durch die Casein Kinase II (CK II) im zellulären Umfeld zu testen.rnIn-vitro konnte die Phosphorylierung der CLR von HSP90-alpha und -beta mit der CK II an den rekombinant hergestellten Proteinen nachgestellt werden. Dieses typische Phosphorylierungs-Motiv (S-X-X-E/D) findet man bei sehr vielen Co-Chaperonen wie auch bei der Prostaglandin E Synthase p23, das ebenfalls durch eine in-vitro Kinase-Reaktion mit der CK II an drei Positionen phosphoryliert wurde. Durch ein Binde-Assay zeigte sich, dass p23 nur in dieser modifizierten Form an HSP90-alpha bindet. Das Bindeverhalten von p23 an die beta-Isoform wird durch diese Phosphorylierung jedoch nicht beeinflusst. Diese Erkenntnisse erweitern das Verständnis des bis dato beschriebenen Chaperon-Zyklus von HSP90 und zeigen deutliche Unterschiede in den Aktivierungszyklen beider Isoformen auf. Da die Casein Kinase II hier entscheidend in den durch HSP90 vermittelten Aktivierungsprozess eingreift, eröffnet sich ein weites Feld an Möglichkeiten, diese Prozesse an weiteren Co-Chaperonen und Substratproteinen zu studieren.rn
The objective of this thesis was the qualification of an analytical method based on mass spectrometry using electrospray ionisation. This method enables the separate determination of the levels of both chaperone isoforms HSP90-alpha and -beta, as well as their phosphorylation status in the so called “charged linker” region.rnThe quantification of the post-translational modification of HSP90 in this little-studied region of the chaperone poses a challenge on the analytical system. This is due to the fact that the region contains solely charged amino acids and the high sequence homology of both isoforms in human cells.rnUsing this method, it could be demonstrated that both isoforms of HSP90 exhibited a higher expression in tumor cell lines compared to non-tumor cell lines. This increased expression results in significantly higher levels of the phosphorylated protein of both isoforms in tumor cell lines. Furthermore, it was shown that only HSP90-alpha is phosphorylated in the resting phase of the cell cycle by selectively arresting cells of the tumor cell line HCT116 in the G0/G1-Phase of the cell cycle.rnDue to the fact that the phosphorylation of the charged linker region of HSP90 can be used as a marker for the activation of substrate proteins, it is now possible to characterise the effect of HSP90 inhibitors on both HSP90 isoforms concerning their expression and the phosphorylation by casein kinase II (CK II) in the cellular environment. rnThis phosphorylation in the charged linker region of HSP90-alpha and -beta was realized in vitro on both recombinant proteins with CK II. The same typical phoshorylation motif (S-X-X-E/D) can be found in many co-chaperones, such as prostaglandin E synthase p23. This prostaglandin E sythase p23 was also phosphorylated in three positions in an in vitro kinase reaction with CK II. In a binding assay it could be demonstrated that only phosphorylated p23 is able to bind to HSP90-alpha. The binding behaviour of p23 to HSP90-beta was not affected by this posttranslational modification.rnThese findings extend the knowledge of the previously described chaperone cycle of HSP90 and show clear differences in the activation cycle of both isoforms. A broad field of possibilities is opened to characterize these processes for further co-chaperones and substrate proteins based on the important influence of the casein kinase II on the activation process mediated by HSP90. rn
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-1337
URN: urn:nbn:de:hebis:77-30817
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: 109 S.
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