Authors:	Nem, Dieudonne
Title:	In vivo and in vitro investigation of the tissue-specific activity of the human CYP3A4 and CYP3A5 promoters
Online publication date:	9-Feb-2012
Year of first publication:	2012
Language:	english
Abstract:	The human cytochrome P450 3A4 (CYP3A4), the predominant but variably expressed cytochrome P450 in adult liver and small intestine is involved in the metabolism of over 50% of currently used drugs. Its paralog CYP3A5 plays a crucial role in the disposition of several drugs with low therapeutic index, including tacrolimus. Limited information is available for the CYP3A5 transcriptional regulation and its induction by xenobiotics remains controversial. In the first part of this study, we analysed the CYP3A5 transcriptional regulation and its induction by xenobiotics in vivo using transgenic mice. To this end, two transgenic strains were established by pronuclear injection of a plasmid, expressing firefly luciferase driven by a 6.2 kb of the human CYP3A5 promoter. A detailed analysis of both strains shows a tissue distribution largely reflecting that of CYP3A5 transcripts in humans. Thus, the highest luciferase activity was detected in the small intestine, followed by oesophagus, testis, lung, adrenal gland, ovary, prostate and kidney. However, no activity was observed in the liver. CYP3A5-luc transgenic mice were similarly induced in both sexes with either PCN or TCPOBOP in small intestine in a dose-dependent manner. Thus, the 6.2 kb upstream promoter of CYP3A5 mediates the broad tissue activity in transgenic mice. CYP3A5 promoter is inducible in the small intestine in vivo, which may contribute to the variable expression of CYP3A in this organ. rnThe hepato-intestinal level of the detoxifying oxidases CYP3A4 and CYP3A5 is adjusted to the xenobiotic exposure mainly via the xenosensor and transcriptional factor PXR. CYP3A5 is additionally expressed in several other organs lacking PXR, including kidney. In the second part of this study, we investigated the mechanism of the differential expression of CYP3A5 and CYP3A4 and its evolutionary origin using renal and intestinal cells, and comparative genomics. For this examination, we established a two-cell line models reflecting the expression relationships of CYP3A4 and CYP3A5 in the kidney and small intestine in vivo. Our data demonstrate that the CYP3A5 expression in renal cells was enabled by the loss of a suppressing Yin Yang 1 (YY1)-binding site from the CYP3A5 promoter. This allowed for a renal CYP3A5 expression in a PXR-independent manner. The YY1 element is retained in the CYP3A4 gene, leading to its suppression, perhaps via interference with the NF1 activity in renal cells. In intestinal cells, the inhibition of CYP3A4 expression by YY1 is abrogated by a combined activating effect of PXR and NF1 acting on their respective response elements located adjacent to the YY1-binding site on CYP3A4 proximal promoter. CYP3A4 expression is further facilitated by a point mutation attenuating the suppressing effect of YY1 binding site. The differential expression of CYP3A4 and CYP3A5 in these organs results from the loss of the YY1 binding element from the CYP3A5 promoter, acting in concert with the differential organ expression of PXR, and with the higher accumulation of PXR response elements in CYP3A4. rn Das humane Zytochrom P450 3A4 (CYP3A4) stellt den größten aber sehr variablen Anteil der Zytochrom P450-Enzyme in der Leber und im Dünndarm Erwachsener dar und ist am Stoffwechsel von über 50% heitig eingesetzter Medikamente beteiligt. Sein Paralog CYP3A5 spielt eine entscheidende Rolle bei der Disposition einiger Arzneimittel mit niedrigem therapeutischem Index, darunter Tacrolimus. Über die transkriptionelle Regulation von CYP3A5 ist nur wenig bekannt und seine Induzierbarkeit durch Xenobiotika bleibt umstritten. Zu Beginn dieser Arbeit wurde die transkriptionelle Regulation von CYP3A5 und seine Induzierbarkeit durch Xenobiotika in vivo an transgenen Mäusen untersucht. Mittels der Mikroinjektionsmethode wurden zwei transgene Mausstämme etabliert, welche das Luziferasegen des Glühwürmchens unter der Kontrolle von 6,2 kbp des humanen CYP3A5-Promotors exprimieren. Eine detaillierte Analyse beider Mausstämme zeigte ein weitgehend mit dem humanen CYP3A5 übereinstimmendes Expressionsmuster. Demnach wurde die höchste Luziferaseaktivität im Dünndarm nachgewiesen, gefolgt von der Speiseröhre, den Hoden, der Lunge, den Nebennieren, den Eierstöcken, der Prostata und den Nieren. Es wurde jedoch keine Aktivität in der Leber detektiert. In CYP3A5-luc transgenen Mäuse beider Geschlechter konnte dosisabhängig eine ähnlich starke Steigerung der Luziferaseaktivität durch PCN oder TCPOBOP im Dünndarm gemessen werden. Zusammengefasst vermitteln die 6,2 kbp des CYP3A5-Promotors die Aktivität in vielen Geweben der transgenen Mäuse. Die Induzierbarkeit von CYP3A5 im Dünndarm könnte ein Grund für die hohe Expressionsvariabilität der CYP3A-Enzyme in diesem Organ sein.rnDie Menge der detoxifizierenden Oxidasen CYP3A4 und CYP3A5 in der Leber und im Dünndarm wird hauptsächlich über den Xenobiotika-Rezeptor und Transkriptionsfaktor PXR gesteuert. CYP3A5 wird aber auch in einigen Organen ohne PXR, wie der Niere, exprimiert. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Mechanismus der differentiellen Expression von CYP3A5 und CYP3A4 sowie deren evolutionärer Ursprung an Nieren- und Dünndarmzellkulturen aber auch mit Hilfe von Genomvergleichen untersucht. Zu diesem Zweck wurden ein Zwei-Zelllinien-Modell etabliert, welches die Expressionsverhältnisse zwischen CYP3A4 und CYP3A5 in der Niere und im Dünndarm in vivo widerspiegelt. Die gewonnenen Daten zeigen, dass die CYP3A5-Expression in Nierenzellen durch einen Verlust der supprimierenden Yin Yang 1 (YY1)-Bindestelle im CYP3A5-Promotor ermöglicht wurde. Die CYP3A5-Expression in der Niere wurde somit von PXR unabhängig. Im CYP3A4-Promotor ist das YY1-Element erhalten und führt so, eventuell durch Wechselwirkung mit dem NF1, zu seiner Supprimierung in Nierenzellen. In Dünndarmzellen wird CYP3A4 exprimiert, da der inhibitorische Effekt von YY1 durch die Aktivierung von PXR in Kombination mit NF1, welche an angrenzende Bindestellen im CYP3A4-Promotor binden, aufgehoben wird. Die CYP3A4-Expression im Dünndarm wird desweiteren unterstützt durch eine Punktmutation, welche den supprimierenden Effekt von YY1 abschwächt. Die differentielle Expression von CYP3A4 und CYP3A5 in diesen Organen resultiert aus einem Verlust der YY1-Bindestelle im CYP3A5-Promotor bei gleichzeitig differentieller Organexpression von PXR sowie einer größeren Anzahl von PXR-Bindestellen im CYP3A4-Promotor.rnrn
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1309
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-30456
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	95 S.
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