Authors:	Scheller, Sabine
Title:	In vivo konditionale Depletion von latentem murinen Cytomegalovirus
Online publication date:	31-Jan-2012
Year of first publication:	2012
Language:	german
Abstract:	Die Lunge stellt einen Hauptort der CMV-Latenz dar. Die akute CMV-Infektion wird durch infiltrierende antivirale CD8 T-Zellen terminiert. Das virale Genom verbleibt jedoch im Lungengewebe in einem nicht replikativen Zustand, der Latenz, erhalten. Es konnte bereits gezeigt werden, dass während der Latenz die Major Immediate Early- (MIE) Gene ie1- und ie2 sporadisch transkribiert werden. Bisher konnte diese beginnende Reaktivierung latenter CMV-Genome nur in einer Momentaufnahme gezeigt werden (Kurz et al., 1999; Grzimek et al., 2001; Simon et al., 2005; zur Übersicht: Reddehase et al., 2008). Die sporadische Expression der MIE-Gene führt jedoch zur Präsentation eines antigenen IE1-Peptids und somit zur Stimulation antiviraler IE1-Peptid-spezifischer CD8 T-Zellen, die durch ihre Effektorfunktion die beginnende Reaktivierung wieder beenden. Dies führte uns zu der Hypothese, dass MIE-Genexpression über einen Zeitraum betrachtet (period prevalence) häufiger stattfindet als es in einer Momentaufnahme (point prevalence) beobachtet werden kann.\r\n\r\nUm die Häufigkeit der MIE-Genexpression in der Dynamik in einem definierten Zeitraum zu erfassen, sollte eine Methode entwickelt werden, welche es erstmals ermöglicht, selektiv und konditional transkriptionell aktive Zellen sowohl während der akuten Infektion als auch während der Latenz auszulöschen. Dazu wurde mit Hilfe der Zwei-Schritt BAC-Mutagenese ein rekombinantes death-tagged Virus hergestellt, welches das Gen für den Diphtherie Toxin Rezeptor (DTR) unter Kontrolle des ie2-Promotors (P2) enthält. Ist der P2 transkriptionell aktiv, wird der DTR an der Zelloberfläche präsentiert und die Zelle wird suszeptibel für den Liganden Diphtherie Toxin (DT). Durch Gabe von DT werden somit alle Zellen ausgelöscht, in denen virale Genome transkriptionell aktiv sind. Mit zunehmender Dauer der DT-Behandlung sollte also die Menge an latenten viralen Genomen abnehmen.\r\n\r\nIn Western Blot-Analysen konnte das DTR-Protein bereits 2h nach der Infektion nachgewiesen werden. Die Präsentation des DTR an der Zelloberfläche wurde indirekt durch dessen Funktionalität bewiesen. Das rekombinante Virus konnte in Fibroblasten in Gegenwart von DT nicht mehr replizieren. In akut infizierten Tieren konnte die virale DNA-Menge durch eine einmalige intravenöse (i.v.) DT-Gabe signifikant reduziert werden. Verstärkt wurde dieser Effekt durch eine repetitive i.v. DT-Gabe. Auch während der Latenz gelang es, die Zahl der latenten viralen Genome durch repetitive i.v. und anschließende intraperitoneale (i.p.) DT-Gabe zu reduzieren, wobei wir abhängig von der Dauer der DT-Gabe eine Reduktion um 60\\% erreichen konnten. Korrespondierend zu der Reduktion der DNA-Menge sank auch die Reaktivierungshäufigkeit des rekombinanten Virus in Lungenexplantatkulturen. \r\n\r\n\r\nUm die Reaktivierungshäufigkeit während der Latenz berechnen zu können, wurde durch eine Grenzverdünnungsanalyse die Anzahl an latenten viralen Genomen pro Zelle bestimmt. Dabei ergab sich eine Kopienzahl von 9 (6 bis 13). Ausgehend von diesen Ergebnissen lässt sich berechnen, dass, bezogen auf die gesamte Lunge, in dem getesteten Zeitraum von 184h durch die DT-Behandlung 1.000 bis 2.500 Genome pro Stunde ausgelöscht wurden. Dies entspricht einer Auslöschung von 110 bis 280 MIE-Gen-exprimierenden Lungenzellen pro Stunde. Damit konnte in dieser Arbeit erstmals die Latenz-assoziierte Genexpression in ihrer Dynamik dargestellt werden.\r\n The lungs are a main target organ of CMV latency. The acute CMV infection is terminated by infiltrating antiviral CD8 T cells. The viral genome remains in lung tissue in a non-replicative state called latency. We could already show that the Major Immediate Early (MIE) genes ie1 and ie2 are sporadically transcribed during latency. Until now the beginning reactivation of latent CMV-genomes could only be shown for a certain time point (Kurz et al., 1999; Grzimek et al., 2001; Simon et al., 2005; for review: Reddehase et al., 2008). \r\n\r\nHowever, the sporadic expression of MIE genes leads to the presentation of an antigenic IE1-peptide and consequently to the stimulation of antiviral IE1-peptide specific CD8 T cells, which terminate the beginning reactivation by their effector function (Simon et al., 2006a). This leads us to the hypothesis that MIE gene expression in a time interval (period prevalence) is a more frequent event that it could be monitored for a certain time point (point prevalence). To acquire the MIE gene expression in its dynamic over a defined period of time a method should be developed to selectively and conditionally deplete transcriptionally active cells in the acute infection as well as during latency, for the first time. Using the two-step BAC mutagenesis technique, a death-tagged recombinant virus was constructed which includes the gene for the diphtheria toxin receptor (DTR) under the control of the ie2-promoter (P2). If P2 is transcriptionally active the DTR is presented on the cell surface and the cells become susceptible for the ligand diphtheria toxin (DT). As a consequence, all cells will be depleted by DT where viral genomes are transcriptionally active. With increasing time of DT treatment the amount of latent viral genomes should be reduced.\r\n\r\nWestern Blot analysis verified expression of the DTR protein 2h post infection. The presentation of the DTR on the cell surface was proved indirectly by its functionality. The recombinant virus failed to replicate in fibroblasts in the presence of DT. In acutely infected animals the amount of viral DNA could be significantly reduced by a single intravenous (i.v.) DT application. This effect was improved by a repetitive i.v. DT treatment. Also during latency we successfully reduced the amount of latent viral genomes by a repetitive i.v. DT application followed by intraperitoneal (i.p.) DT application, where we reached an reduction of 60\\% dependent on the period of DT treatment. Corresponding to the DNA amount reduction, the frequency of reactivation of the recombinant virus in lung explant cultures was also reduced.\r\n\r\nTo calculate the reactivation frequency during latency we had to determine the number of latent viral genomes per cell with the help of a limiting dilution analysis. This results in a copy number of 9 (6 to 13). Based on these results we could demonstrate that, related to the whole lung, in the tested time period of 184 hours about 1,000 to 2,500 genomes per hour were reduced by DT. This corresponds to a depletion of 110 to 280 MIE gene expressing lung cells per hour. So in this work we demonstrated for the first time the latency associated gene expression in its dynamic.\r\n
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1292
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-30138
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	226 S.
Appears in collections:	JGU-Publikationen