Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-1247
Authors: Saur, Michael
Title: Three-dimensional electron microscopy of myriapod hemocyanin, planorbid snail acetylcholine-binding protein and cyanobacterial Vipp1
Online publication date: 28-Aug-2015
Language: english
Abstract: Three-dimensional electron microscopy (3-D EM) provides a framework for the analysis of large protein quaternary structures. The advantage over the generally higher resolving meth- od of X-ray crystallography is the embedding of the proteins in their physiological environ- ment. However, results of the two methods can be combined to obtain superior structural information. In this work, three different protein types – (i) Myriapod hemocyanin, (ii) vesi- cle-inducing protein in plastids 1 (Vipp1) and (iii) acetylcholine-binding protein (AChBP) – were structurally analyzed by 2-D and 3-D EM and, where possible, functionally interpreted.rnMyriapod hemocyanins have been previously shown to be 6x6-meric assemblies that, in case of Scutigera coleoptrata hemocyanin (ScoHc), show two 3x6-mer planes whith a stag- gering angle of approximately 60°. Here, previously observed structural differences between oxy- and deoxy-ScoHc could be substantiated. A 4° rotation between hexamers of two dif- ferent 3x6-mer planes was measured, which originates at the most central inter-hexamer in- terface. Further information about allosteric behaviour in myriapod hemocyanin was gained by analyzing Polydesmus angustus hemocyanin (PanHc), which shows a stable 3x6-mer and divergent histidine patterns in the inter-hexamer interfaces when compared to ScoHc. Both findings would conclusively explain the very different oxygen binding properties of chilopod and diplopod hemocyanin.rnVipp1 is a protein found in cyanobacteria and higher plants which is essential for thyla- koid membrane function and forms highly variable ring-shaped structures. In the course of this study, the first 3-D analysis of Vipp1 was conducted and yielded reconstructions of six differently sized Vipp1 rings from negatively stained images at resolutions between 20 to 30 Å. Furthermore, mutational analyses identified specific N-terminal amino acids that are essential for ring formation. On the basis of these analyses and previously published results, a hypothetical model of the Vipp1 tertiary and quaternary structure was generated.rnAChBP is a water-soluble protein in the hemolymph of mollusks. It is a structural and functional homologue of the ligand-binding domain of nicotinic acetylcholine receptors. For the freshwater snail Biomphalaria glabrata, we previously described two types of AChBP (BgAChBP1 and BgAChBP2). In this work, a 6 Å 3-D reconstruction of native BgAChBP is presented, which shows a dodecahedral assembly that is unprecedented for an AChBP. Single particle analysis of recombinantely expressed BgAChBP types led to preliminary results show- ing a dodecahedral assembly of BgAChBP1 and a dipentameric assembly of BgAChBP2. This indicates divergent biological functions of the two types.
Die dreidimensionale Elektronenmikroskopie (3-D EM) ermöglicht die strukturelle Analyse großer Proteinquartärstrukturen. Gegenüber der grundsätzlich höher auflösenden Röntgenkristallographie bietet diese Methode den Vorteil, die zu untersuchenden Proteinkomplexe unter physiologischen Pufferbedingungen abbilden zu können. Beide Methoden können kombiniert werden, um verbes- serte Strukturinformationen zu erhalten. In der vorliegenden Arbeit wurden drei unterschiedliche Proteintypen – (i) Myriapodenhämocyanin, (ii) vesikelinduzierendes Protein in Plastiden 1 (Vipp1) und (iii) Acetylcholin-bindendes Protein (AChBP) – mittels 2-D und 3-D EM untersucht und nach Möglichkeit einer funktionellen Analyse unterzogen.rnMyriapodenhämocyanin wurde als 6x6-mere Struktur beschrieben, die – im Falle des Scutigera co- leoptrata Hämocyanins (ScoHc) – aus zwei um ca. 60° gegeneinander verdrehten 3x6-meren Ebenen besteht. Diese Arbeit konnte zuvor beschriebene strukturelle Unterschiede zwischen oxy- und deoxy- ScoHc bestätigen und zeigt eine 4°-Rotation zwischen zwei Hexameren unterschiedlicher 3x6-mer- Ebenen auf, welche durch eine zentral gelegene histidinreiche, inter-hexamere Kontaktstelle eingelei- tet zu werden scheint. Die strukturelle Analyse des Polydesmus angustus Hämocyanins (PanHc) lieferte weitere Hinweise auf die allosterische Regulation in Myriapodenhämocyaninen, da dieses als stabiles 3x6-mer vorliegt und, verglichen mit ScoHc, Unterschiede in der Histidinverteilung innerhalb der inter-hexameren Kontaktstellen aufweist.rnVipp1 wird in Cyanobakterien und höheren Pflanzen exprimiert, ist essentiell für den Aufbau der Thylakoidmembranen und bildet sehr heterogene, ringartige Strukturen aus. Dreidimensionale Analysen von Vipp1 wurden bisher allerdings nicht durchgeführt. Im Zuge dieser Arbeit war es mög- lich, mittels 3-D EM aus negativ-kontrastierten Proben sechs unterschiedlich große Vipp1-Ringe mit Auflösungen zwischen 20 und 30 Å zu rekonstruieren. Desweiteren konnten mittels Mutagenesestu- dien spezifische N-terminale Aminosäuren identifiziert werden, die für die Ringbildung essentiell zu sein scheinen. Auf der Grundlage dieser und zuvor publizierter Ergebnisse, wurde ein hypothetisches Modell der Tertiär- und Quartärstruktur von Vipp1 erstellt.rnAChBP ist ein wasserlösliches Protein in der Hämolymphe von Mollusken. Es ist strukturell und funktionell homolog zu der Ligandenbindedomäne der nikotinischen Acetylcholinrezeptoren. Die Süßwasserschnecke Biomphalaria glabrata exprimiert zwei verschiedene AChBP-Typen (BgAChBP1 und BgAChBP2). In dieser Arbeit wurde eine 3-D Rekonstruktion des nativen BgAChBPs mit einer Auflösung von 6 Å erstellt, welche die für AChBP zuvor nicht bekannte Struktur eines pentagonalen Dodekaeders zeigt. Einzelpartikelanalyse von rekombinant exprimiertem BgAChBP1 und BgACh- BP2 ergab eine Dodekaederstruktur für BgAChBP1 und eine Dipentamerstruktur für BgAChBP2. Dies deutet auf eine unterschiedliche biologische Funktion der beiden Isoformen hin.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-1247
URN: urn:nbn:de:hebis:77-41521
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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