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Authors: Kolarow, Richard
Title: Signalling mechanisms affecting regulated neurotrophin secretion in hippocampal neurons
Online publication date: 26-Aug-2015
Language: english
Abstract: Die Neurotrophine aus Säugetiere BDNF und NT-3 sind von Neuronen sekretierte Wachstumsfaktoren. Ferner sind Neurotrophine in verschiedene Formen der aktivitätsabhängigen synaptische Plastizität involviert. Obwohl die Ausschüttung von Neurotrophine aus Synapsen beschrieben worden ist, sind die intrazellulären Signalkaskaden, die die synaptische Ausschüttung von Neurotrophine regulieren, bei weitem nicht verstanden. Deswegen ist die Analyse der Sekretion von Neurotrophine auf subzellulärer Ebene erforderlich, um die genaue Rolle von präsynaptische und postsynaptische NT-Sekretion in der synaptischen Plastizität aufzudecken. In der vorliegenden Arbeit wurden die Kulturen von dissoziierten hippocampalen Neuronen aus Ratten mit grün fluoreszierenden Protein-markierten Konstrukten von BDNF und NT-3 transfiziert und Neurotrophine-enthaltenden Vesikeln durch die Colokalisierung mit dem cotransfizierten postsynaptischen Marker PSD-95-DsRed an glutamatergen Synapsen identifiziert. Depolarisationsinduzierte Sekretion von BDNF und NT-3 wurde per Direktaufnahme am Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Die unvermittelte postsynaptische Depolarisation mit erhöhtem Kalium, in Gegenwart von Inhibitoren der synaptischen Transmission, erlaubte die Untersuchung der Signalwege, die am postsynaptischen Sekretionsprozess der Neurotrophinvesikel beteiligt sind. Es konnte gezeigt werden, dass die depolarisationsinduzierte postsynaptische Ausschüttung der Neurotrophine durch Calcium-Einstrom ausgelöst wird, entweder über L-Typ-spannungsabhängige Calcium-Kanäle oder über NMDA-Rezeptoren. Eine anschließende Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern über Ryanodin-Rezeptoren ist für den Sekretionsprozess erforderlich. Die postsynaptische Neurotrophinausschüttung wird durch KN-62 und KN-93 gehemmt, was auf eine unmittelbare Abhängigkeit von aktiver alpha-Calcium-Calmodulin-abhängige Proteinkinase II (CaMKII) hinweist. Der Inhibitor der cAMP/Proteinkinase A (PKA), Rp-cAMP-S, sowie der NO-Donor, SNP, minderten die Neurotrophinausschüttung. Hingegen blieben die Erhöhung des intrazellulären cAMP und der NO-Synthase-Inhibitor L-NMMA ohne Wirkung. Mit dem Trk-Inhibitor K252a konnte gezeigt werden, dass autokrine Neurotrophin-induzierte Neurotrophinausschüttung nicht an der synaptischen Freisetzung der Neurotrophine beiträgt und, dass BDNF seine eigene postsynaptische Sekretion nicht auslöst. Freisetzungsexperimente mit dem Fluoreszenz-Quencher Bromphenolblau konnten den Nachweis erbringen, dass asynchrone und anhaltende Fusionsporenöffnung von Neurotrophinvesikeln während der Sekretion stattfindet. Wegen der im Vergleich zum komplexen Sekretionsprozess schnellen Fusionsporenöffnung, scheint die Freisetzungsgeschwindigkeit von Neurotrophine durch ihre Diffusion aus dem Vesikel begrenzt. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse eine starke Abhängigkeit der aktivitätsabhängigen postsynaptischen Neurotrophinausschüttung vom Calcium-Einstrom, von der Freisetzung von Calcium aus internen Speichern, von der Aktivierung der CaMKII und einem intakten Funktion der PKA, während der Trk-Signalweg, die Aktivierung von Natrium-Kanäle und NO-Signale nicht erforderlich sind.
The mammalian neurotrophins (NTs) BDNF and NT-3 are secreted neuronal growth factors. In addition, NTs are implicated in several forms of activity-dependent synaptic plasticity. Although synaptic secretion of NTs has been described, the intracellular signalling cascades that regulate synaptic secretion of NTs are far from being understood. Analysis of neurotrophin secretion at the subcellular level is thus required to resolve the role of presynaptic and postsynaptic neurotrophin secretion for synaptic plasticity. In the present work, cultures of dissociated rat hippocampal neurons were transfected with green fluorescent protein-tagged versions of BDNF and NT-3, respectively, and NT vesicles were identified at glutamatergic synapses by co-localization with the co-transfected postsynaptic marker PSD-95-DsRed. Depolarization-induced secretion of BDNF and NT-3 was monitored via live cell imaging. Direct postsynaptic depolarization with elevated potassium in the presence of blockers of synaptic transmission allowed investigation of the signalling cascades that are involved in the postsynaptic neurotrophin vesicle secretion process. It could be shown that depolarization-induced postsynaptic neurotrophin secretion is elicited by calcium influx, either via L-type voltage-gated calcium channels or via NMDA receptors. Subsequent release of calcium from internal stores via ryanodine receptors is required for the secretion process. Postsynaptic neurotrophin secretion is inhibited in the presence of KN-62 and KN-93, indicating a critical dependence on the activation of alpha-calcium-calmoduline-dependent protein kinase II (CaMKII). The cAMP/protein kinase A (PKA) signalling inhibitor, Rp-cAMP-S, as well as the NO donor, SNP, impaired neurotrophin secretion, whereas elevation of intracellular cAMP levels and the NO synthase inhibitor L-NMMA were without effect. Using the Trk inhibitor k252a, it could be shown that neurotrophin-induced neurotrophin secretion does not contribute to the neurotrophin release process at synapses, and BDNF does not induce its own secretion at postsynaptic sites. Release experiments in the presence of the fluorescence quencher bromophenol blue provide evidence for asynchronous and prolonged fusion pore opening of neurotrophin vesicles during secretion. Because fusion pore opening is fast compared with compound release, the speed of NT release seems to be limited by diffusion of NTs out of the vesicle. Together, these results reveal a strong dependence of activity-dependent postsynaptic neurotrophin secretion on calcium influx, calcium release from internal stores, activation of CaMKII, and intact PKA signalling, whereas Trk signalling, activation of sodium channels and NO signalling are not required.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-1244
URN: urn:nbn:de:hebis:77-41497
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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