Authors:	Leidecker, Nadine
Title:	Identifizierung, Expression und Charakterisierung des Nanos-verwandten Proteins aus dem marinen Schwamm Suberites domuncula
Online publication date:	26-Aug-2015
Year of first publication:	2015
Language:	german
Abstract:	Im Rahmen dieser Arbeit konnte in dem marinen Schwamm Suberites domuncula ein Gen identifiziert werden, dessen C-terminale konservierte Domäne eine hohe Sequenzähnlichkeit zu den Zinkfingerdomänen der Nanos-Proteine aufweist. Weiter konnte ein N-terminales Sequenzmotiv identifiziert werden, das eine hohe Sequenzidentität zu den konservierten NIM Motiven (CNOT1-interagierendes-Motiv) von Nanos zeigt. Nach der Klonierung der cDNA erfolgte die Expression des als Sd_nrp bezeichneten Proteins in E. coli Bakterien, für dessen 231 Aminosäuren umfassende Polypeptidkette eine theoretische Molekülmasse von 25.8 kDa berechnet wurde. Anschließend gelang ein Nachweis des Proteins mithilfe eines polyklonalen, gegen Sd_nrp gerichteten Antikörpers in drei Gewebetypen, dem Pinacoderm, den Primmorphen (3D-Zellaggregate) und den Gemmulae (Dauerstadien der Schwämme). Dabei konnte die höchste Expression von Sd_nrp in den als totipotent geltenden Stammzellen der Schwämme, den Archaeocyten innerhalb der Gemmulae beobachtet werden. Die Identifizierung der Zellstrukturen, erfolgte dabei aufgrund morphologischer Vergleiche. Speziell die Merkmale der Zellen in den Gemmulae, der große Nukleus, die amöboide Form sowie die granulären Reservesubstanzen, entsprechen den typischen morphologischen Eigenschaften der Archaeocyten, und bestätigen die Interpretation der Ergebnisse. Weiter konnte mit Hilfe des Anti-Sd_nrp Antikörpers das native Protein in Proteinextrakten aus Gewebe adulter Tiere nachgewiesen werden. Die vergleichende Sequenzanalyse von Sd_nrp mit dem Nanos-verwandten Protein der Schwammspezies Ephydatia fluviatilis und die phylogenetische Stammbaum-Analyse mit Nanos-Homologen unterschiedlicher Invertebraten und Vertebraten lässt die Schlussfolgerung zu, dass es sich bei dem hier identifizierten Protein Sd_nrp um ein Nanos-verwandtes Protein handelt. Darüber hinaus konnte anhand eines Homologiemodells bestätigt werden, dass es sich bei der konservierten C-terminalen Domäne des Proteins Sd_nrp um die für Nanos-Proteine spezifische Zinkfingerstruktur mit dem konservierten Sequenzmotiv CCHC handelt. Dieses Ergebnis konnte auch bei einem Vergleich der Zinkfingerdomäne von Sd_nrp mit den Zinkfingerdomänen der Nanos-Homologen unterschiedlicher Invertebraten- und Vertebratenspezies bestätigt werden. Within the scope of this thesis, a particular gene of the marine sponge Suberites domuncula, has been identified. The C-terminal domain of the encoding protein showed a high sequence similarity to the zinc finger domain of the Nanos protein family. Additionally an N-terminal sequence motif was recognized with high sequence similarity to the NIM motif (CNOT1-interacting motif) of Nanos proteins. The cloning of the cDNA was followed by heterologous recombinant expression in E. coli. For its 231 amino acid long polypeptide chain a theoretical molecular mass of 25.8 kDa was calculated and designated as Sd_nrp. Subsequently the detection of the protein was achieved in three types of tissue, the pinacoderm, the primmorphs (3D cell aggregates) and the gemmules (resting stages of sponges) respectively, using a polyclonal anti Sd_nrp antibody. Thereby the highest expression of Sd_nrp could be observed in the archaeocytes within the gemmules, which are classified as the totipotent stem cells of sponges. The identification of cellular structures was carried out based on morphological comparisons. Specifically, the characteristics of the cells in the gemmules, the large nucleus, the amoeboid form and the granular reserve substances meet the typical morphological characteristics of archaeocytes, and confirm the interpretation of the results. Furthermore the native protein could also be detected in tissue extracts from adult animals using the anti-Sd_nrp antibody. The comparative sequence analysis of Sd_nrp with the Nanos related protein from the sponge species Ephydatia fluviatilis and the phylogenetic tree analysis with Nanos homolog proteins from different invertebrates and vertebrates reveal that Sd_nrp is a nanos-related protein. Moreover, it was assumed on the basis of a homology model that the conserved C-terminal domain of the protein Sd_nrp, is the zinc finger structure with the conserved sequence motif CCHC, which is a unique characteristic of Nanos proteins. This result was also confirmed by a comparison of the zinc finger domain of Sd_nrp with the zinc finger domains of Nanos homolog proteins from different invertebrate and vertebrate species.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1242
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-41460
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Appears in collections:	JGU-Publikationen