Untersuchung der Expression zentraler Mitophagie-Regulatorproteine im humanen Zellmodell der Parkinsonschen Krankheit
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In der vorliegenden Arbeit wurden die Konsequenzen der MPP+-Exposition auf die Morphologie, Dynamik und die Elimination von Mitochondrien bzw. auf die Expression zentraler Mitophagie-Regulatorproteine bei der Parkinsonschen Krankheit, einer chronischen und progredienten
neurodegenerativen Erkrankung, im humanen Zellmodell erforscht. Mitochondrien sind bei der Parkinsonschen Krankheit stark betroffen, da unter anderem mitochondriale Dysfunktion und oxidativer Stress eine Rolle in der Pathogenese der Krankheit spielen. Mitochondriale Dysfunktion geht mit epigenetischen Veränderungen einher, die mit einer erhöhten Expression zellkernkodierter Untereinheiten der mitochondrialen Atmungskette verbunden sind. Da dies möglicherweise ein kompensatorischer Mechanismus der Neurone ist, die mitochondriale Funktion zu verbessern und aufrecht zu erhalten, sollten in dieser Arbeit die Auswirkungen einer Inhibition der mitochondrialen Atmungskette auf die mitochondriale Morphologie, Dynamik und Elimination der Mitochondrien untersucht werden. Darüber hinaus sollten die Effekte von Phenothiazin auf diese Prozesse untersucht werden.
Es zeigten sich unter Exposition mit 10 μM MPP+ und dem MitoTracker Red Farbstoff morphologische Veränderungen in den untersuchten LUHMES-Zellen, die mit einer erhöhten Fragmentierung von Mitochondrien vereinbar sind. Diese Ergebnisse ähnelten denen, die von Prasertsuksri et al. und Jang et al. beschrieben wurden (Prasertsuksri et al., 2023; Jang et al., 2018). Weiterhin zeigte sich, dass MPP+ als bekannter Komplex-I-Inhibitor in LUHMES-Zellen nicht zu einer kompletten Inhibition des Komplex I führte. Eine Komplex-I-Inhibition führt generell zu einer erhöhten ROS-Produktion (Kitamura et al., 1998; Rossetti et al., 1988), beeinträchtigt die oxidative Phosphorylierung und involviert eine verminderte ATP-Synthese (Ramsay et al., 1991; Di Monte et al., 1986). Mit einer verminderten ATP-Synthese geht wiederum ein Verlust des Δψm einher (Blum et al., 2001). Dies hat Konsequenzen auf verschiedene Stoffwechselpfade bzw. Funktionen der Mitochondrien.
Die Proteinimportmaschinerie betreffend zeigte sich, dass MPP+ zu einer signifikanten Reduktion des TIM23-Proteinspiegels führte. Da der Proteinimport an der IMM vom Δψm abhängig ist (Becker et al., 2019), deutet der signifikant reduzierte TIM23-Proteinspiegel auf eine mögliche Co-
Regulation von Δψm und TIM23 hin. Reduzierte TIM23-Spiegel sind bekanntermaßen mit einem beeinträchtigten Proteinimport an der IMM verbunden (Franco-Iborra et al., 2018). Als Konsequenzen der MPP+-Behandlung auf die mitochondriale Dynamik zeigten sich signifikant reduzierte Proteinspiegel für das membrangebundene mitochondriale Fissionsprotein Mff und die ebenfalls membrangebundenen Fusionsproteine Mfn1, Mfn2 und Opa1, was auf einen Verlust dieser Proteine durch Induktion der Mitophagie hindeutet. Das zytosolische Fissionsprotein DLP1 hingegen war unter MPP+ kaum verändert, was damit erklärt werden könnte, dass es entweder konstant reguliert wird oder eine geringere Rolle bei der Fission spielt als bisher angenommen. Dies zeigen auch Ergebnisse aus Knockout-Mäusen, in denen es trotz DLP1-Mangel zu Mitophagie kam (Burman et al., 2017).
Die Untersuchung des sehr gut bekannten PINK1/Parkin-abhängigen Mitophagieweges zeigte überraschenderweise und entgegen der Erwartung keine erhöhten PINK1-Proteinspiegel als Korrelat einer Aktivierung dieses Signalweges, sondern einen tendenziell erniedrigten Proteinspiegel. Auch das zytosolische Parkin war tendenziell vermindert. Möglicherweise könnte es durch Aktivierung eines alternativen Signalwegs zu einer Indifferenz von PINK1 und Parkin auf MPP+ kommen. Daher wurde der BNIP3L/Nix-vermittelte Mitophagie-Signalweg ebenfalls untersucht. Hier zeigte sich ein hochsignifikantes Ergebnis mit stark reduzierten Proteinspiegeln unter MPP+, was vermuten lässt, dass in LUHMES-Zellen unter MPP+ nicht der PINK1/Parkin-Signalweg, sondern der rezeptorvermittelte BNIP3L/Nix-Signalweg aktiviert wird. Eine Induktion der Mitophagie unter MPP+ führt somit einerseits zur Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase, indem dysfunktionale und geschädigte Mitochondrien eliminiert werden,
andererseits kann eine gesteigerte Mitophagie durch vermehrte Fissionsereignisse mit einem solchen Verlust an Mitochondrien verbunden sein, dass es zu einer Störung des mitochondrialen Stoffwechsels kommt (Jin et al., 2018; Pöltl et al., 2012).
Es bedarf zukünftiger weiterer Untersuchungen, um insbesondere die hier erhaltenen Ergebnisse der BNIP3L/Nix-vermittelten Mitophagie zu untermauern und weiter zu erforschen.
In dieser Arbeit wurde auch die antioxidative Wirkung von Phenothiazin (PHT) auf die MPP+-induzierte Modulation der mitochondrialen Morphologie, Dynamik und Mitophagie analysiert. Dabei konnte mit einer niedrigen nanomolaren Konzentration von 20 nM gezeigt werden, dass
PHT auf die morphologischen Veränderungen unter MPP+ einen ausgeprägten und deutlich sichtbar revertierenden Effekt hat. Da die Komplex-I-Inhibition durch MPP+ einerseits mit einer erhöhten ROS-Produktion (Kitamura et al., 1998; Rossetti et al., 1988) und dem Risiko für oxidativen Stress einhergeht (Drechsel und Patel, 2008), in dessen Folge Mitochondrien geschädigt werden, andererseits mit einer Beeinträchtigung der OXPHOS und dem Risiko für den Verlust des Δψm mit Depolarisation, benötigt das Mitochondrium eine homöostatische Antwort. Die selektive Abtrennung geschädigter Anteile mit noch vorhandenem Δψm konnte gezeigt werden. PHT lieferte durch seinen deutlich mindernden Effekt auf die Fragmentierung den Nachweis, dass es vor oxidativer Schädigung schützen und die mitochondriale Integrität zu erhalten vermag. Diese Ergebnisse ähnelten denen von PHT in vivo, das in dopaminergen Neuronen der Substantia nigra eine antioxidative Wirkung zeigte und signifikant vor Schäden
durch oxidativen Stress schützen konnte (Tapias et al., 2019).
Für die Fissionsproteine Mff und DLP1, die Fusionsproteine Mfn1 und Mfn2 sowie die Mitophagieproteine PINK1 und Parkin konnten allenfalls mild schützende Wirkungen von PHT beobachtet werden, die jedoch nicht signifikant waren. Dies impliziert, dass die Mito-Fission und Mito-Fusion hier im wesentlichen ROS-unabhängig induziert wurden. Für die Translokase der inneren Mitochondrienmembran TIM23 und das Fusionsprotein der inneren Mitochondrienmembran Opa1, deren beide Funktionen vom Δψm über der inneren Mitochondrienmembran abhängen, konnten die unter MPP+ signifikant reduzierten Proteinspiegel durch die Gabe von PHT signifikant erhöht werden. PHT zeigte also einen signifikanten Effekt und war möglicherweise in der Lage, das Δψm zu schützen. Diese Ergebnisse koinzidieren durchaus mit in vivo-Neuronen, in denen PHT die Komplex-I-Aktivität stabilisieren (Tapias et al., 2019) und zur Aufrechterhaltung des Δψm beitragen konnte.