Analysen zur Kernlokalisation der castor mRNA im sich entwickelnden zentralen Nervensystem von Drosophila melanogaster
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Abstract
In dieser Arbeit wurden die Mechanismen der im Kern retenierten cas mRNA im embryonalen und larvalen Nervensystem von Drosophila melanogaster untersucht. Aus vorhergehenden Arbeiten konnte eine Involvierung der Introns und UTR’s in die Kernrückhaltung weitestgehend ausgeschlossen werden und das mögliche Sequenzmotiv auf die kodierende Sequenz von cas eingeengt werden. Durch In-frame-Deletionen innerhalb der CDS und die ektopische Expression der generierten cas-Deletionskonstrukte in der Epidermis von Stadium 11 Embryonen konnte das erste kb der kodierenden Sequenz von cas als notwendig zur Kernretention ermittelt werden. Da weitere gezielte In-frame-Deletionen zur Einengung des Retentionssignals nicht zum Erfolg führten, ist zu vermuten, dass entweder das gesamte 1kb große Fragment oder mehrere über diesen Bereich verteilte Sequenzen zur Kernrückhaltung notwendig sind. Erstere Theorie wurde anhand eines Fusionskonstrukts aus dem 1 kb der cas-CDS und nGFP getestet. Es zeigte sich, dass das erste kb von cas nicht ausreichend zur Kernrückhaltung von nGFP ist. Es ist daher zu vermuten, dass möglicherweise ein zweiter Sequenzabschnitt oder die Sekundärstruktur Einfluss auf die Funktionalität der Kernretention der cas mRNA hat. Der Einbau zufällig gewählter Spacersequenzen im mittleren Bereich des ersten kbs und die damit einhergehende vorzeitige Entlassung der cas mRNA aus dem Kern unterstützen diese Theorie.
Ein zweiter Ansatz zur Ermittlung der Retentionssequenz der cas mRNA, führte zur Isolation einer 58 Bp langen Sequenz, die für den Kernrückhalt der cas mRNA notwendig ist. Innerhalb dieser Sequenz befindet sich ein zweiteiliger Zipcode, der erstmals als notwendig zur Lokalisation von ß–Aktin im Hühnchen ermittelt wurde. Die gezielte Deletion des Zipcodes führte zu einer vorzeitigen Entlassung der cas mRNA aus dem Zellkern. Auch der Austausch einzelner Basen innerhalb dieses Retentionssignals ohne die Veränderung der Aminosäuresequenz des Cas Proteins führte zu dem direkten Export der cas mRNA aus dem Zellkern und zeigt die Notwendigkeit dieses Sequenzmotivs für die Kernrückhaltung.
Des Weiteren wurde der Einfluss möglicher RNA-Bindeproteine auf die Kernrückhaltung der cas mRNA untersucht. Aufgrund des bereits erwähnten Zipcodes wurde der mit dImp assoziierte grk-Lokalisationskomplex als eventuell Einfluss nehmender Faktor berücksichtigt. Hierunter befinden sich die Proteine Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein at 27C (Hrb27C, auch Hrp48), Squid (Sqd) und Syncrip (Syp). Diese drei RNA-Bindeproteine sind alle Mitglieder der hnRNP Familie und neben der Lokalisation von grk, auch in die Lokalisation von osk involviert und somit vielversprechende Kandidaten für die Kernrückhaltung der cas mRNA. Anhand von Antikörperfärbungen der einzelnen Komplexkomponenten konnte jedoch keine Kolokalisation der einzelnen Faktoren nachgewiesen werden.
In einem weiteren Ansatz wurde die Relevanz der Sekundärstruktur der cas mRNA auf die Kernrückhaltung untersucht. Eine sich in der Sequenz wiederholende Triplettabfolge, welche in der Sekundärstruktur der mRNA zu einer auffälligen Loop-Bildung führt, weist auf die Involvierung von Mbl hin. Mbl bindet die, in den betroffenen mRNAs entstehenden doppelsträngigen, Stem-loops und bildet intranukleäre Cluster, welche unter anderem, Kennzeichnung der humanen Krankheit Myotone Dystrophie (MD) sind. In dieser Arbeit konnte die Kolokalisation von Mbl und Cas nachgewiesen werden. Des Weiteren zeigt sich ein auffälliger cas mRNA-Phänotyp beim Knock-down von Mbl in der L3-Wanderlarve. Dies spricht für eine Rolle von Mbl in den Mechanismus der cas mRNA Kernrückhaltung.