Authors:	Jüngling, Antje
Title:	Analysen zur Kernlokalisation der castor mRNA im sich entwickelnden zentralen Nervensystem von Drosophila melanogaster
Online publication date:	6-Nov-2018
Year of first publication:	2018
Language:	german
Abstract:	In dieser Arbeit wurden die Mechanismen der im Kern retenierten cas mRNA im embryonalen und larvalen Nervensystem von Drosophila melanogaster untersucht. Aus vorhergehenden Arbeiten konnte eine Involvierung der Introns und UTR’s in die Kernrückhaltung weitestgehend ausgeschlossen werden und das mögliche Sequenzmotiv auf die kodierende Sequenz von cas eingeengt werden. Durch In-frame-Deletionen innerhalb der CDS und die ektopische Expression der generierten cas-Deletionskonstrukte in der Epidermis von Stadium 11 Embryonen konnte das erste kb der kodierenden Sequenz von cas als notwendig zur Kernretention ermittelt werden. Da weitere gezielte In-frame-Deletionen zur Einengung des Retentionssignals nicht zum Erfolg führten, ist zu vermuten, dass entweder das gesamte 1kb große Fragment oder mehrere über diesen Bereich verteilte Sequenzen zur Kernrückhaltung notwendig sind. Erstere Theorie wurde anhand eines Fusionskonstrukts aus dem 1 kb der cas-CDS und nGFP getestet. Es zeigte sich, dass das erste kb von cas nicht ausreichend zur Kernrückhaltung von nGFP ist. Es ist daher zu vermuten, dass möglicherweise ein zweiter Sequenzabschnitt oder die Sekundärstruktur Einfluss auf die Funktionalität der Kernretention der cas mRNA hat. Der Einbau zufällig gewählter Spacersequenzen im mittleren Bereich des ersten kbs und die damit einhergehende vorzeitige Entlassung der cas mRNA aus dem Kern unterstützen diese Theorie. Ein zweiter Ansatz zur Ermittlung der Retentionssequenz der cas mRNA, führte zur Isolation einer 58 Bp langen Sequenz, die für den Kernrückhalt der cas mRNA notwendig ist. Innerhalb dieser Sequenz befindet sich ein zweiteiliger Zipcode, der erstmals als notwendig zur Lokalisation von ß–Aktin im Hühnchen ermittelt wurde. Die gezielte Deletion des Zipcodes führte zu einer vorzeitigen Entlassung der cas mRNA aus dem Zellkern. Auch der Austausch einzelner Basen innerhalb dieses Retentionssignals ohne die Veränderung der Aminosäuresequenz des Cas Proteins führte zu dem direkten Export der cas mRNA aus dem Zellkern und zeigt die Notwendigkeit dieses Sequenzmotivs für die Kernrückhaltung. Des Weiteren wurde der Einfluss möglicher RNA-Bindeproteine auf die Kernrückhaltung der cas mRNA untersucht. Aufgrund des bereits erwähnten Zipcodes wurde der mit dImp assoziierte grk-Lokalisationskomplex als eventuell Einfluss nehmender Faktor berücksichtigt. Hierunter befinden sich die Proteine Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein at 27C (Hrb27C, auch Hrp48), Squid (Sqd) und Syncrip (Syp). Diese drei RNA-Bindeproteine sind alle Mitglieder der hnRNP Familie und neben der Lokalisation von grk, auch in die Lokalisation von osk involviert und somit vielversprechende Kandidaten für die Kernrückhaltung der cas mRNA. Anhand von Antikörperfärbungen der einzelnen Komplexkomponenten konnte jedoch keine Kolokalisation der einzelnen Faktoren nachgewiesen werden. In einem weiteren Ansatz wurde die Relevanz der Sekundärstruktur der cas mRNA auf die Kernrückhaltung untersucht. Eine sich in der Sequenz wiederholende Triplettabfolge, welche in der Sekundärstruktur der mRNA zu einer auffälligen Loop-Bildung führt, weist auf die Involvierung von Mbl hin. Mbl bindet die, in den betroffenen mRNAs entstehenden doppelsträngigen, Stem-loops und bildet intranukleäre Cluster, welche unter anderem, Kennzeichnung der humanen Krankheit Myotone Dystrophie (MD) sind. In dieser Arbeit konnte die Kolokalisation von Mbl und Cas nachgewiesen werden. Des Weiteren zeigt sich ein auffälliger cas mRNA-Phänotyp beim Knock-down von Mbl in der L3-Wanderlarve. Dies spricht für eine Rolle von Mbl in den Mechanismus der cas mRNA Kernrückhaltung. The cas mRNA of Drosophila melanogaster is subject to extensive posttranscriptional regulation. Newly transcribed cas mRNA is initially retained in the nucleus until it is released into cytoplasm during the following mitotic division. The significance of these observations as well as the underlying mechanisms was investigated in the embryonic and larval nervous system of Drosophila melanogaster. Previous investigations showed that intron and UTR sequences are not responsible for the retention. The responsible sequence motif must therefore lie in the coding sequence (CDS) of cas. Through in frame deletions and ectopic expression of numerous cas deletion constructs in the epidermis of stage 11 embryos the first kb of the CDS of cas could be identified as necessary for the nuclear retention. As further deletion constructs could not narrow down the retention signal, it is possible that the entire kb or two or more sequences within the first kb are responsible for the nuclear retention. The former theory was tested by the ectopic expression of a cas-nGFP fusion construct. It could be shown that the first kb of cas is not sufficient to retain nGFP inside the nucleus of epidermal cells. There must therefore be a second sequence or some secondary structure which influences the nuclear retention of the cas mRNA. This theory was supported by the integration of random spacer sequences in the central part of the first kb, which caused a premature release of the cas mRNA. A second approach led to the isolation of a 58 bp long sequence. This sequence contains a bipartite zipcode, which was shown to be necessary for the localization of the ß-actin mRNA in chicken. The deletion of this zipcode in the cas CDS resulted in a premature release of the cas mRNA. The mutation of single bases of the zipcode without changing the amino acid sequence of the cas protein produced the same effect. These results show the necessity of this sequence motif for the nuclear retention of cas. In addition to mentioned results, the effect of known RNA binding proteins of the grk localisation complex on the nuclear retention of the cas mRNA was investigated. RNA binding proteins of this complex includes the Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein at 27C (Hrb27C, Hrp48), Squid (Sqd) and Syncrip (Syp). These RNA binding proteins are all part of the hnRNP family and are involved in the localization of grk and osk, and therefore good candidates for a participation in the nuclear retention of cas. This was tested by Immunostaining. A colocalization of the RNA binding proteins with cas mRNA could not be shown. At last the potential relevance of a secondary structure of the cas mRNA on its nuclear retention was tested. A repeating RNA triplet, whose secondary structure forms a known double-strand stem loop, suggests the involvement of the RNA binding protein Muscleblind (Mbl). Mbl binds to these stem loops and forms intranuclear clusters. These clusters are characterization of the human disorder Myotonic dystrophy (MD). It could be shown that Mbl and Cas colocalize in the larval brain of Drosophila melanogaster and that the knockdown of Mbl shows a noticeable cas mRNA phenotype in the L3 larvae.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1185
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000023665
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	167 Blätter
Appears in collections:	JGU-Publikationen