Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-1179
Authors: Neumann, Jan
Title: Development and application of advanced fluorescence microscopy techniques for the investigation of inflammatory processes
Online publication date: 30-Oct-2018
Language: english
Abstract: The innate immune system is the first barrier against pathogens and induces fast immune responses. Hereby the Toll-like receptor 4 (TLR4) plays a key role by detecting damage- and pathogen-associated molecular patterns (DAMPs, PAMPs) like lipopolysaccharides (LPS), an outer cell wall component of gram-negative bacteria. Activation of TLR4 leads to a nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-κB) dependent signal transduction into the cell nucleus. TLR4 can be activated not only by LPS, but also by amylase trypsin inhibitors (ATI). ATI comprise a family of small proteins that are associated with gluten containing grains like wheat, barley or rice. Consumption of food containing ATI can therefore cause intestinal inflammation. Studies that microscopically investigate the effect of ATI on the molecules involved in the TLR4 signaling pathway are limited. In this study, single molecule localization microscopy (SMLM) and high-content screening microscopy (HCS) were used to study both, the membrane distribution of TLR4 and the translocation of NF-κB into the cell nucleus in primary human macrophages after ATI or LPS stimulation. To investigate the membrane distribution of TLR4 below the optical diffraction limit, a SMLM microscope was constructed during this thesis and algorithms for quantitative evaluation of the measured distribution of TLR4 molecules were implemented. SMLM microscopy revealed that more than 60 % of TLR4 molecules are part of a cluster, with diameters between 46 nm to 57 nm. Upon stimulation with ATI or LPS a tendency towards the formation of smaller and less dense clusters was observed. At the same time, the percentage of molecules that are part of a cluster increased. These results suggest that TLR4 molecules are recruited into specific domains consisting of monomers or lower order oligomers, which indicates the formation of signaling platforms. In addition, the use of HCS microscopy showed that ATI treatment induces the translocation of NF-κB into the cell nucleus. Quantitative differences in the response between the individual donors were observed. Together, the results show a comparable influence of ATI on both the supramolecular distribution of TLR4 and the translocation of NF-κB into the cell nucleus, as observed for LPS. In addition, the algorithms implemented for evaluating the membrane distribution of TLR4 will be helpful in future experiments for quantifying SMLM data with high signal densities and a large number of samples.
Das angeborene Immunsystem spielt eine wichtige Rolle, indem es eindringende Krankheitserreger erkennt und zu einer schnellen Immunreaktion führt. Der Toll-like Rezeptor 4 (TLR4) erkennt schaden- und pathogen-assoziierte molekulare Muster (DAMP, PAMP) wie zum Beispiel Lipopolysaccharide (LPS), welches ein Hauptbestandteil der äußeren Zellwand von gramnegativen Bakterien ist. Die Aktivierung von TLR4 führt zu einer NF-κB abhängigen Signalübertragung in den Zellkern. Dabei kann die Aktivierung von TLR4 nicht nur durch LPS erfolgen, sondern auch durch Amylase-Trypsin-Inhibitoren (ATI). ATI sind eine Proteinfamilie, die in glutenhaltigem Getreide wie Weizen, Gerste oder Reis vorkommen. Der Verzehr von ATI-haltigen Lebensmitteln kann daher Darmentzündungen verursachen. Nur wenige mikroskopische Studien haben sich bisher mit ATI induzierter TLR4 Aktivierung und die an der Signaltransduktion beteiligten Moleküle befasst. In dieser Studie wurden Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) und High-Content-Screening-Mikroskopie (HCS) verwendet, um sowohl die Membranverteilung von TLR4, als auch die Translokation von NF-κB in den Zellkern, auf primären menschlichen Makrophagen nach ATI- und LPS-Stimulation zu untersuchen. Um die Membranverteilung von TLR4 unterhalb der optischen Beugungsgrenze zu untersuchen, wurde im Rahmen dieser Arbeit ein SMLM-Mikroskop konstruiert und Algorithmen zur quantitativen Auswertung der gemessenen Verteilung von TLR4-Molekülen implementiert. Mittels SMLM-Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass mehr als 60 % der TLR4 Moleküle Teil eines Rezeptorclusters sind. Die Cluster wiesen einen Durchmesser von 46 nm bis 57 nm auf. Stimulierung mit ATI und LPS führte dazu, dass eine Tendenz zur Bildung von kleineren und weniger dichten Clustern zu beobachten war. Gleichzeitig stieg der Anteil der Moleküle, die Teil eines Clusters sind. Diese Resultate deuten darauf hin, dass TLR4-Moleküle in bestimmte Domänen rekrutiert werden, die aus Monomeren oder Oligomeren niedriger Ordnung bestehen, was eine Bildung von Signalplattformen nahelegt. Ergänzend konnte durch die Benutzung der HCS-Mikroskopie gezeigt werden, dass ATI Stimulation im weiteren Signalverlauf die Translokation von NF-κB in den Zellkern induziert. Dabei konnten quantitative Unterschiede in der Reaktion zwischen den einzelnen Spendern beobachtet werden. Zusammengefasst zeigen die Resultate einen vergleichbaren Einfluss von ATI, sowohl auf die supramolekulare Verteilung von TLR4 als auch auf die Translokation von NF-κB in den Zellkern, wie es auch für LPS beobachtet wurde. Darüber hinaus werden die implementierten Algorithmen, welche zur Auswertung der Membranverteilung von TLR4 benutzt wurden, in zukünftigen Experimenten helfen, SMLM Daten mit hohen Signaldichten und einer großen Probenanzahl auszuwerten.
DDC: 500 Naturwissenschaften
500 Natural sciences and mathematics
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: MaxPlanck GraduateCenter
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-1179
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: vii, 176 Seiten
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