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Authors: Seack, Jürgen
Title: Struktur, Funktion und potentielle Anwendung der PKC- und SNZ,SNO-Promotoren aus Geodia cydonium und Suberites domuncula
Online publication date: 1-Jan-2000
Language: german
Abstract: Die Schwämme (Porifera) sind eine reiche Quelle bioaktiver Naturstoffe. Viele dieser Naturstoffe besitzen das Potential, als Pharmazeutika, molekulare Sonden usw. eingesetzt oder weiterentwickelt zu werden. Die Beschaffung dieser Naturstoffe in ausreichenden Mengen stellt jedoch eines der größten Probleme bei der Testung und Produktion vielversprechender Substanzen dar. Der Transfer von DNA in Schwammzellen bzw. in komplette Organismen wäre ein vielversprechender Ansatz, dieses Problem zu lösen. Das Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die Funktion und Struktur homologer Promotoren zu untersuchen und eine Methode des Gentransfers in Schwammzellen auszuarbeiten. Zu diesem Zweck wurde zusätzlich zu der bereits vorhandenen 5'-flankierenden Region des conventional PKC-Gens aus Geodia cydonium eine genomische Bibliothek von Suberites domuncula konstruiert, um diese mit Hilfe des DNA-Homologiescreenings nach den 5'-flankierenden Regionen des cPKC- und des SNZ (SnooZe)-Gens (SD_SNZG) zu durchsuchen. Die Klonierung und Sequenzierung sowohl des 5'-Bereichs als auch die Charakterisierung der Exon-Intron Struktur beider Gene wurde erfolgreich durchgeführt. In der 5'-Region des SNZ-Gens konnte dabei ein weiteres Gen (SD_SNO; SNZ proximal Open Reading Frame) identifiziert werden, das in einer 'Kopf-an-Kopf' Anordnung zu SD_SNZG orientiert ist. Sowohl SD_SNZG als auch SD_SNO wurden hochkonservierten Genfamilien zugeordnet, deren Vorkommen in Metazoen hier erstmals beschrieben wird.Funktionelle Studien mit Hilfe der Reportergene Luciferase und Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) im heterologen System der NIH 3T3 Zellen wiesen sowohl dem cPKC-Promotor aus G. cydonium als auch dem SNZ-Promotor aus S. domuncula eine starke Promotoraktivität im Verhältnis zum SV40-Promotor nach. Die Aktivität des cPKC-Promotors aus S. domuncula dagegen war relativ schwach. Darüber hinaus konnte geklärt werden, daß die 5'-flankierende Region des SNZ-Gens bidirektionale Promotoraktivität aufweist und daß der G. cydonium cPKC-Promotor keine TATA-Box besitzt, sondern eine GC-Box für die basale Funktion benötigt.Als geeignete Methode zur Transfektion von Zellen des Schwamms S. domuncula erwies sich der ballistische Gentransfer mit Hilfe der Gene Gun. Homologe Promotoren konnten die sichtbare Expression des Reportergens EGFP jedoch nicht bewirken. Nur der virale CMV-Promotor erwies sich als hierfür geeignet.
Sponges (Porifera) represent a rich source of bioactive compounds. A lot of these compounds have the potential to be used as or to be developed to pharmaceuticals, molecular probes etc.. The supply with these natural products in sufficient amounts is one of the greatest problems when testing or producing promising compounds. The transfer of DNA into sponge cells or complete animals respectively would be a promising start to solve this problem. The aim of this study was therefore to investigate the function and structure of homologous promoters and to find a method of transfering DNA into sponge cells.For that reason additive to the 5'-flanking region of the conventional PKC gene from Geodia cydonium a genomic library from Suberites domuncula was constructed in order to screen this library by homologous DNA-hybridization for the 5'-regions of the cPKC and SNZ (SD_SNZ) genes. The cloning, sequencing and characterization of both the 5'-region and the exon-intron structure of the two genes were completed successfully. In the 5'-region of the SNZ gene a further open reading frame coding for the so called SNO gene (SD_SNO), which is positioned in a head-to-head configuration, was discovered. SD_SNZ as well as SD_SNO are members of highly conserved gene families. Their occurrence in metazoa is described here for the first time.Functional studies with the reporter genes luciferase and EGFP showed, that both the cPKC promoter from G. cydonium and the SNZ promoter from S. domuncula possess a high activity in the heterologous system of NIH 3T3 cells. The activity of the S. domuncula cPKC promoter was relatively weak. Furthermore it could be shown, that the 5'-flanking region of the SNZ gene has bidirectional promoter activity and that the G. cydonium cPKC promoter is TATA-less, but needs a GC-box for basal activity.A suitable method for the transfection of S. domuncula cells is the transfer by ballistics using a gene gun. Homologous promoters couldn't drive the visible expression of the reporter gene EGFP. Only the viral CMV promoter could be proven to be functional.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-1066
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
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