Authors:	Allgayer, Julia
Title:	Verschiedene Modi der Transkriptionshemmung durch 8-Oxo-7,8-dihydroguanin (8-oxoG) in der DNA
Online publication date:	3-Nov-2016
Year of first publication:	2016
Language:	german
Abstract:	8-Oxo-7,8-dihydroguanin (8-oxoG) ist eine der am häufigsten auftretenden oxidativen DNA-Basenmodifikationen, deren Entfernung aus der DNA über den Mechanismus der Basen-Exzisions-Reparatur verläuft. Neben seinen prämutagenen Eigenschaften hat 8-oxoG auch Auswirkungen auf die Gentranskription. Mit Hilfe eines Vektor-basierten Reportersystems konnte bereits früher gezeigt werden, dass die Exzision eines einzelnen 8-oxoG innerhalb des EGFP-Reportergens durch die BER-initiierende DNA-Glykosylase OGG1 zu einer Hemmung der Genexpression führt. Ziel dieser Arbeit war zu untersuchen inwieweit sich der direkte DNA-Sequenzkontext von 8-oxoG auf die Stärke dieser Hemmung auswirkt. Des Weiteren sollte untersucht werden welches Reparaturintermediat des 8-oxoG diese Hemmung verursacht, welcher Mechanismus ihr zu Grunde liegt und wie ein einzelnes 8-oxoG innerhalb regulatorischer Elemente die Genexpression beeinflusst. Zu diesem Zweck wurden EGFP-Reportervektoren konstruiert, die 8-oxoG in verschiedenen DNA-Sequenzen an verschiedenen Positionen innerhalb des Vektors enthielten. Die Auswirkungen von 8-oxoG und dessen Reparatur auf die Expression des Reportergens wurde durch Transfektion humaner Zelllinien und Messung der EGFP-Expression bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass 8-oxoG im DNA-Sequenzkontext 5′-A[8-oxoG]C die Genexpression stärker hemmt als 8-oxoG im Kontext 5′-C[8-oxoG]G, was darauf zurückgeführt werden konnte, dass die Exzision von 8-oxoG durch OGG1 aus ersterem DNA-Kontext etwa 3 bis 4 mal effizienter verläuft. Die Bedeutung von OGG1 für die Entstehung der Transkriptionshemmung wurde auch dadurch bestätigt, dass 8-oxoG in HeLa-Zellen, in denen OGG1 durch shRNA permanent herunterreguliert worden war, deutlich geringere Auswirkungen auf die EGFP-Expression zeigte. Da die Expressionshemmung auch auftrat, wenn sich 8-oxoG innerhalb des nichttranskribierten DNA-Strangs befand, liegt die Vermutung nahe, dass es sich hierbei nicht um eine direkte Blockade der RNA-Polymerase, sondern um einen bisher unbekannten Mechanismus der Genstilllegung handelt. Um nun herauszufinden welches Reparaturintermediat des 8-oxoG für die Hemmung der Genexpression verantwortlich ist, wurden Vektoren verwendet, bei denen 8-oxoG auf einer oder beiden Seiten von nukleaseresistenten Phosphothioatbindungen flankiert war. Vektoren mit einem Phosphothioat 5′ von 8-oxoG waren inert gegenüber der Exzision von 8-oxoG durch Zellextrakte und in Zellen zeigte sich bei diesen Vektoren keine Hemmung der Genexpression durch 8-oxoG. Dies deutet darauf hin, dass die Transfektionshemmung durch die APE1-vermittelte Überführung der AP-Läsion in einen DNA-SSB verursacht wird. Die durch 8-oxoG ausgelöste Genrepression wurde weiter untersucht und es konnte gezeigt werden, dass diese Genstilllegung nicht von einem spezifischen Element des verwendeten, viralen CMV-IE-Promotors abhängig ist. Da der inhibierende Effekt von 8-oxoG durch den HDAC-Inhibitor TSA vollständig aufgehoben werden konnte, scheinen Histondeacetylasen (HDACs) eine entscheidende Rolle bei der Entstehung der Genrepression zu spielen. Durch einen transienten Knockdown der HDACs 1, 2 und 3 sollte die Beteiligung spezifischer HDACs an dieser Genrepression ermittelt werden, doch die Ergebnisse blieben inkonklusiv. Doch nicht nur innerhalb des transkribierten Bereichs kann 8-oxoG die Genexpression beeinträchtigen: Befand sich das einzelne 8-oxoG innerhalb des regulatorischen Elements CRE (cAMP response element) zeigte sich dieselbe Genrepression, die auch an allen anderen Positionen beobachtet wurde. Besteht der Promotor des Reportergens allerdings nur aus diesem einen CRE, zeigt sich bereits zum frühesten untersuchten Zeitpunkt eine Hemmung der Genexpression, was auf eine direkte Hemmung hindeutet. Tatsächlich konnte mittels eines EMSA bewiesen werden, dass diese direkte Hemmung durch die Beeinträchtigung der Bindung des Transkriptionsfaktors CREB zu CRE verursacht wird. Weitere Experimente mit Vektoren, die 5-mC, 5-hmC, 5-fC, 5-caC oder 5-hmU enthielten, konnten zeigen, dass all diese DNA-Basenmodifikationen bei einer Positionierung innerhalb von CRE ebenfalls die Bindung von CREB beeinträchtigen. Die Modifikationen 5-fC, 5-caC und 5-hmU zeigten zusätzlich eine zu 8-oxoG analoge kontinuierliche Abnahme der Genexpression, die ebenfalls auf die Exzision der Modifikationen durch DNA-Glykosylasen zurückgeführt werden konnte. Dies deutet darauf hin, dass es sich bei der durch 8-oxoG verursachten Genstilllegung nicht um einen für 8-oxoG spezifischen Mechanismus handelt, sondern um einen Mechanismus der allen Substraten der BER gemein ist. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass 8-oxoG unabhängig von seiner Position die Genexpression durch einen HDAC-abhängigen Stilllegungsmechanismus hemmt. Des Weiteren kann 8-oxoG innerhalb eines Promotorelements die Genexpression auch direkt durch Modulation der Transkriptionsfaktorbindung beeinflussen. The oxidative DNA base modification 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) is removed by base excision repair (BER) initiated by the DNA glycosylase OGG1. The aim of this work was to investigate the influence of the DNA sequence context, the position and the excision of 8-oxoG on gene expression. Host cell reactivation assays with vectors containing a single 8-oxoG in different positions within the reporter gene showed that 8-oxoG inhibits gene transcription after its excision by OGG1 and this excision is dependent on the DNA sequence context. Using DNA backbone modifications was further shown that the enzymatic activity responsible for the gradual decrease of transcription is APE1 and a cellular silencing mechanism. This mechanism might be conveyed by HDACs since use of an HDAC inhibitor was able to counteract the repressive effect of single 8-oxoG. If 8-oxoG was positioned inside a regulatory promoter element it inhibits gene expression additionally by inhibiting transcription factor binding. All together this work reveals new insight into the effects of 8-oxoG on gene transcription, the role of OGG1 and APE1 and a possible role of HDAC in this mechanism.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1043
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000007588
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	XII, 249 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen