Optimisation of next generation sequencing methodologies for RNA modifications detection
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Ribonukleinsäure (RNA) ist ein wesentliches Biomolekül im Bereich des Lebens. Als Vermittler zwischen der in der Desoxyribonukleinsäure (DNA) enthaltenen genetischen Information und der Zelle hat ihre Regulierung einen großen Einfluss auf die Homöostase lebender Organismen. Die Entdeckung und Identifizierung chemischer Veränderungen auf Nukleotidebene in der RNA hat es ermöglicht, eine neue Ebene der Regulierung dieser Moleküle zu untersuchen. Angesichts der Bedeutung dieser chemischen Veränderungen im Bereich der Biologie wurde ein spezieller Begriff für die Untersuchung dieser Modifikationen geprägt: Epitranskriptomik. Mehr als 170 Modifikationen wurden inzwischen aufgelistet, und ihre Analyse hat zur Entdeckung zahlreicher Verbindungen zwischen diesen Veränderungen und verschiedenen Krankheiten wie Virusinfektionen, Krebs und neurodegenerativen Erkrankungen geführt. Die Epitranskriptomik birgt daher die Hoffnung auf die Entwicklung innovativer Behandlungen für bisher unheilbare Krankheiten.
Von der großen Zahl der bisher identifizierten Modifikationen gibt es jedoch nur wenige Methoden, mit denen sie in RNA-Sequenzen genau lokalisiert werden können. Um diese Einschränkungen zu überwinden, befassen sich die hier vorgestellten Arbeiten mit der Entwicklung und Optimierung von Methoden zum Nachweis von Modifikationen durch Hochdurchsatz-Sequenzierung. Genauer gesagt liegt der Schwerpunkt dieser Arbeit auf der computergestützten Verarbeitung von Sequenzierungsdaten, um den Nachweis dieser modifizierten Nukleotide zu perfektionieren.
In einem ersten Schritt wurde eine Methode zum Nachweis von 2'-O-Methylierungen mittels Hochdurchsatzsequenzierung (RiboMethSeq) auf transfer-RNA (tRNA) Proben aus Escherichia coli und Saccharomyces cerevisiae angewandt, um die Rolle dieser Modifikationen in der angeborenen Immunität zu untersuchen. Diese Studie enthüllte interessante Details über die Regulierung der Immunität, zeigte aber auch die Nachweisgrenzen von RiboMethSeq auf. Diese Einschränkungen sind hauptsächlich auf die nicht optimale Parametrisierung der verschiedenen Datenverarbeitungsstufen zurückzuführen, aber auch auf den Mangel an tRNA-Sequenzreferenzen, die für epitranskriptomische Studien geeignet sind. Diese Einschränkungen wurden gezielt angegangen, und es wurde eine gründliche Optimierung dieser beiden Konzepte vorgenommen, so dass in einer zweiten Studie die Zusammenhänge zwischen 2'-O-Methylierungen und angeborener Immunität eingehender analysiert werden können. Mit dem Ziel, die Grenzen der Erkennung von 2'-O-Methylierungen zu verschieben, wird schließlich das Potenzial von Deep-Learning-Algorithmen für die Erkennung von Modifikationen unter Verwendung von RiboMethSeq ribosomale RNA-Daten als Trainingsset für den Random Forest-Algorithmus erforscht.
Zweitens werden alternative Methoden für den Nachweis von zwei Modifikationen, N6-Methlyadenosin (m6A) und Pseudouridin (Psi), entwickelt. Bestehende Nachweismethoden für diese Modifikationen weisen aufgrund der Art des gewählten Ansatzes Beschränkungen auf. Um diese Lücken zu schließen, wurden zwei alternative Verfahren vorgeschlagen, die auf der Induktion chemischer Signaturen beruhen, die von diesen Modifikationen ausgehen, und dann auf biologische Proben angewandt, wobei ihre Robustheit bei der Erkennung sowie ihre Qualität bei der Quantifizierung dieser Biomoleküle von Interesse bewiesen wurden.
Die Arbeit schließt mit der gleichzeitigen Anwendung von drei Nachweismethoden - RiboMethSeq, AlkAnilineSeq und BisulfiteSeq - auf denselben Satz von Gehirnzellproben im Rahmen von Studien über neurodegenerative Erkrankungen. Die Kombination dieser Methoden ermöglichte es, fünf menschliche tRNA-Modifikationen zu kartieren und ihre jeweilige Quantifizierung je nach Art des Zellgewebes und der Stressbedingungen zu bestimmen. Diese Arbeit hat es uns ermöglicht, bereits in der Literatur gemachte Beobachtungen zu bestätigen, aber auch eine noch wenig untersuchte Modifikation, Dihydrouridin, als potenziell entscheidenden Faktor bei der tRNA-Fragmentierung herauszustellen.