Authors:	Juárez Núñez, Karla Azucena
Advisor:	Khmelinskii, Anton
Title:	Asymmetric protein inheritance in yeast replicative aging
Online publication date:	11-Apr-2024
Year of first publication:	2024
Language:	english
Abstract:	In contemporary research, the utilization of diverse tags like fluorescent proteins or small epitopes, for the investigation of proteins of interest has become ubiquitous. Normalizing the extensive usage of tags has made us overlook the critical question of how each tag influences the functionality, subcellular localization and interactions with protein-protein networks of the respective protein of interest. In this study I sought to shed light on this topic by systematically analyzing the effect of external tags on different proteins in budding yeast, Saccharomyces cerevisiae. To achieve this goal, I chose to assess the impact of tag position, at C-terminus or N-terminus, on a given protein. In order to conduct a genome-wide comparison of the tag position effects, I selected the non-fluorescent protein Halo tag. The Halo tag is a commonly used tag that has a similar size to commonly used fluorescent proteins, rendering it a suitable model for extrapolating its effects to tags of similar sizes. Additionally, for distinguishing between C-terminusly and N-terminusly tagged strains, I decided to use different cytosolic markers for each strain type. I conducted a comparative analysis between ORF-3xMyc-Halo and Halo-3Myc-ORF libraries, which I also constructed, to evaluate the effects of tagging proteins at the C-termius and at the N-terminus. To ensure a fair comparison between the two, I developed a high-throughput yeast competition assay in liquid medium. This study involved competing 5,340 strain pairs over a four-day period, with the identification of C-tagged and N-tagged cells accomplished through cytosolic fluorescence measurements via flow cytometry. After the genome-wide competition, I noted two significant observations. First, there is a general trend towards enhanced strain fitness when ORFs are tagged at the C-terminus. I identified 292 ORFs that demonstrate improved fitness when tagged at the N-terminus, 4310 ORFs that show no significant difference in fitness based on tag position and 649 ORFs that exhibit enhanced fitness when tagged at the C-terminus. Secondly, essential genes appear to be particularly susceptible to the impact of tagging, in contrast to non-essential genes. This observation aligns with the notion that any disturbance to essential genes has a more detrimental effect. In this study, I generated a comprehensive genome-wide catalog that identifies the protein terminus at which introducing a tag is less detrimental to the final strain’s fitness. After this initial finding, I proceeded to leverage this information to investigate replicative aging in budding yeast. Given the organisms' asymmetrical replication, I employed a tandem fluorescent protein timer (tFT) to track proteins with age-dependent subcellular distributions during mitosis. After evaluating various tFT options, I opted to create a library in which 5,561 ORFs were tagged at the C-terminus with the selected tFT, mScarlet-I-mNeonGreen. Following the establishment of a high-throughput imaging protocol, I conducted imaging of the aforementioned library to obtain protein age data of each protein pool in both the mother and the daughter cells during mitosis. After manually annotating proteins that displayed asymmetrical segregation based on their age, I identified 775 proteins of interest. It is important to emphasize that these hits will require further validation through our automated image analysis pipeline. However, this initial exploration suggests a promising approach for identifying candidate proteins whose age may correlate with cellular damage and, ultimately, the aging of the cell receiving the older protein pool. Completing this analysis will also yield a new catalog of proteins in budding yeast that could be potentially acting as aging factors. In der heutigen Forschung ist der Einsatz verschiedenster Proteinmarkierungen, mittels beispielsweise fluoreszierenden Proteinen oder kleinen Epitopen, zur Untersuchung von spezifischen Proteinen allgegenwärtig geworden. Der zur Normalität gewordene Einsatz von solch umfangreichen Markierungen hat uns jedoch die kritische Frage übersehen lassen, inwieweit eben jene Markierungen die Funktionalität, die subzelluläre Lokalisation und die Interaktionen in Protein-Protein-Netzwerken eines jeweiligen Proteins beeinflusst. In dieser Arbeit habe ich versucht dieses Thema näher zu beleuchten, indem ich die Auswirkungen von Markierungen auf verschiedene Proteine in der Bierhefe Saccharomyces cerevisiae systematisch analysiert habe. Um dieses Ziel zu erreichen, entschied ich mich die Auswirkungen der Markierungsposition am C-Terminus oder N-Terminus eines gegebenen Proteins zu bewerten. Um einen genomweiten Vergleich der Auswirkungen der Markierungsposition durchzuführen, wählte ich die nicht-fluoreszierende Markierung namens Halo-Tag aus. Der Halo-Tag ist eine häufig verwendete Markierung, die eine ähnliche Größe wie andere beliebte, fluoreszierende Proteine besitzt. Diese Eigenschaft macht es zu einem geeigneten Modell um seine Auswirkungen auf Markierungen ähnlicher Größe zu extrapolieren. Zusätzlich entschied ich mich für die Verwendung unterschiedlicher zytoplasmatischer Markierungen für C-terminal und N-terminal markierte Stämme, um diese voneinander zu unterscheiden. Ich führte einen Vergleich zwischen ORF-3xMyc-Halo und Halo-3xMyc-ORF-Bibliotheken durch, die ich ebenfalls erstellte, um die Auswirkungen von C-terminaler und N-terminaler Markierung zu bewerten. Um einen fairen Vergleich zwischen beiden herzustellen, entwickelte ich eine Hochdurchsatz-Konkurrenzuntersuchung in flüssigem Medium. Diese Studie umfasste die Konkurrenz von 5340 Hefestamm-Paaren über einen Zeitraum von vier Tagen, wobei die Identifikation von C-markierten und N-markierten Zellen durch zytoplasmatische Fluoreszenzmessungen mittels Durchflusszytometrie erfolgte. Nach der genomweiten Konkurrenzuntersuchung stellte ich zwei wichtige Beobachtungen fest. Erstens, es besteht eine allgemeine Neigung zu einer verbesserten Fitness der Hefestämme, wenn ORFs am C-Terminus markiert sind. Ich identifizierte 292 ORFs die bei Markierung des N-Terminus eine verbesserte Fitness zeigten. Bei 4.310 ORFs konnten keine signifikanten Unterschiede in der Fitness in Abhängigkeit der Markierungsposition festgestellt werden, und 649 ORFs zeigten eine erhöhte Fitness bei Markierung des C-Terminus. Zweitens, essentielle Gene scheinen besonders anfällig für die Auswirkungen der Markierung zu sein. Diese Beobachtung steht im Einklang mit der Auffassung, dass Störungen in essentiellen Genen schwerwiegendere Auswirkungen haben. Mit dieser Studie leiste ich einen Beitrag zur wissenschaftlichen Gemeinschaft, indem ich einen umfassenden, genomweiten Katalog vorstelle, der die bevorzugte Markierungsposition eines Proteins identifiziert und dadurch die Fitness-Nachteile des endgültigen Stammes minimiert. Auf Grundlage der erhobenen Daten, untersuchte ich zudem das Altern durch Replikation in Saccharomyces cerevisiae. Aufgrund der asymmetrischen Replikation der Bierhefe verwendete ich einen Tandem-Fluoreszenzprotein-Timer (tFT), um Proteine mit altersabhängigen, subzellulären Lokalisationen während der Mitose zu verfolgen. Nachdem ich verschiedene tFT-Optionen geprüft hatte, entschied ich mich eine Bibliothek zu erstellen, in der 5.561 ORFs am C-Terminus mit dem ausgewählten tFT namens mScarlet-I-mNeonGreen markiert wurden. Um Daten bezüglich des Alters für jede Proteingruppe in sowohl Mutter- als auch Tochterzellen während der Mitose zu erhalten, wurde die erstellte Bibliothek unter Verwendung eines Hochdurchsatz-Bildgebungs-Protokolls untersucht. Nach der manuellen Annotation von Proteinen, die eine asymmetrische Segregation basierend auf ihrem Alter zeigten, identifizierte ich 775 Proteine für zukünftige Studien. Es ist wichtig zu betonen, dass eine weitere Validierung durch unseren automatisierten Bildanalysen-Algorithmus erforderlich ist. Dennoch deuten diese vorläufigen Ergebnisse auf einen vielversprechenden Ansatz hin, mit welchem Proteine identifiziert werden können, deren Alter womöglich mit zellulären Schäden und letztendlich mit dem Altern der Zelle korrelieren. Eine abschließende Analyse wird zu einem neuen Proteinkatalog führen, welcher potentielle Alternsfaktoren identifiziert.
DDC:	000 Allgemeines 000 Generalities 570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-10227
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-2a7bbc23-5cd4-4858-891f-e6fc59f290634
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	CC BY-ND
Information on rights of use:	https://creativecommons.org/licenses/by-nd/4.0/
Extent:	113 Seiten ; Illustrationen, Diagramme
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