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Authors: Gerlach, Ulrich
Title: Einzelmolekül-Untersuchungen zu Faltung und Zusammenbau des Lichtsammelkomplexes LHCII
Online publication date: 8-Dec-2010
Year of first publication: 2010
Language: german
Abstract: Zusammenfassung\r\n Der Faltungsprozess des Hauptlichtsammelkomplexes des Photosystems II aus höheren Pflanzen (light harvesting complex II, LHCII) wurde bereits mehrfach untersucht, die Experimente hierzu fanden stets im Ensemble statt. Anhand der bislang veröffentlichten Faltungskinetiken des LHCII aus höheren Pflanzen lassen sich aber keine eindeutigen Aussagen bezüglich der Diversität der Faltungswege treffen. Daher sollten im Rahmen dieser Arbeit Faltungskinetiken einzelner LHCII-Moleküle während der Komplexbildung aufgenommen werden, um weitergehende Informationen zum Faltungsmechanismus zu erhalten und zur Frage, ob hier mehrere unterschiedliche Wege eingeschlagen werden.\r\nHierfür war zunächst die Etablierung einer Oberflächenimmobilisierung mit Glas als Trägermaterial notwendig. Nachdem Versuche, diese Immobilisierung über einen His6-tag oder über einen heterobifunktionellen Linker zu bewerkstelligen, nicht zum Erfolg geführt haben, konnte eine Immobilisierung des Biotin-markierten Proteins an Oberflächen-gebundenes Avidin erreicht werden. Die Qualität dieser Immobilisierung wurde hierbei sowohl über Bindungsversuche mit fluoreszenzfarbstoffmarkiertem Protein als auch über eine direkte Kontrolle der Oberflächenbeschaffenheit mittels Rasterkraftmikroskopie überprüft. Die für die folgenden Versuche optimale Belegungsdichte wurde im konfokalen Fluoreszenzmikroskop ermittelt. Zudem wurde sichergestellt, dass die Proteine vereinzelt auf der Oberfläche immobilisiert vorliegen.\r\nAuf dieser Basis wurden LHCII-Komplexe, die zuvor in vitro rekonstituiert wurden, immobilisiert und Versuche zur kontrollierten Denaturierung unternommen, um Zerfalls-kinetiken im Verfahren der internen Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (total internal reflection fluorescence, TIRF) aufnehmen zu können. Hierbei traten Schwierigkeiten bezüglich der Lebensdauer der Komplexe unter Laser-Belichtung auf, da sich die Löschung der Fluoreszenz durch Zerstrahlung der Pigmente einerseits oder Dissoziation der LHCII andererseits nicht unterscheiden ließen. Auch durch verschiedene Maßnahmen zur Erhöhung der Lebensdauer konnte diese nicht in dem Maße gesteigert werden, wie es experimentell notwendig gewesen wäre.\r\nFür das eigentliche Hauptziel dieser Arbeit – die Aufzeichnung von Einzelmolekül-Faltungskinetiken – war die Entwicklung einer Methode zur Rekonstitution oberflächen-immobilisierter LHCII-Apoproteine notwendig. Dieses Ziel wurde mithilfe einer Detergenzmisch-Rekonstitution erreicht. Der Erfolg der Rekonstitution konnte experimentell sowohl im Fluorimeter anhand des komplexinternen Energietransfers auf einen kovalent an das Protein gebundenen Infrarot-Fluorophor als auch im TIRF-Verfahren direkt beobachtet werden. Auch hier konnte nach ca. 80 Sekunden ein Ausbleichen der Komplexe während der Belichtung durch den Anregungs-Laser beobachtet werden.\r\nIn Versuchen zur Beobachtung des Komplexbildungsvorganges zeigte sich, dass die Rekonstitution offenbar durch die Belichtung massiv gestört wird. Ein weiteres Problem war eine sehr starke Hintergrundfluoreszenz, ausgelöst durch die zur Rekonstitution notwendige Pigmentlösung, die trotz der TIRF-Anregung von ausschließlich oberflächengebundenem Material die Fluoreszenz der Komplexe überlagerte. Somit konnte die Rekonstitution oberflächenimmobilisierter LHCII-Proteine zwar in Vorher-Nachher-Aufnahmen gezeigt werden, der Faltungsprozess an sich konnte dagegen im Rahmen dieser Arbeit nicht aufgezeichnet werden.
Summary\r\n The folding of the main light-harvesting complex of photosystem II from higher plants (light-harvesting complex II, LHCII) has already been researched several times. Previously published folding kinetics of LHCII from higher plants are unequivocal regarding the diversity of folding pathways. So far all experiments focused on assembly measurements. This work researches the LHCII folding kinetics of individual molecules during the complex formation, aiming to obtain further information about the folding mechanism and to clarify whether there are several different folding pathways involved.\r\nAt first it was necessary to establish an immobilization procedure with glass as a substrate. Biotin-labelled proteins were immobilized to surface-bound avidin, after first attempts via a heterobifunctional His6-tag or via a linker were not successful. The quality of this immobilization was ascertained in two ways: by binding experiments with fluorescence-dye labelled proteins and via direct control of the surface by atomic force microscopy (AFM).\r\nThe optimum protein density for the sequentially experiments was determined in the confocal fluorescence microscope. Moreover, it was ensured that single proteins are immobilized on the surface.\r\nOn this presumption previously in vitro reconstituted LHCII complexes were immobilized and experiments of controlled denaturation were carried out in order to measure decay kinetics using the total internal reflection fluorescence (TIRF). Difficulties arose with respect to the lifetime of the complexes under laser exposure. The source of fluorescence quenching could not explicitly be assigned to severly damaged pigments or dissociated LHCII. Even various measures to increase the lifetime of the complexes were not successful to such a degree, as it would have been experimentally necessary.\r\nFor the real objective of this work - the monitoring of single-molecule folding kinetics - a method to reconstitute surface-immobilized LHCII-apoproteins had to be developed. This aim was achieved by using a mixed detergent-reconstitution.\r\nThe success of the reconstitution experiments could be observed directly in two ways: In the fluorimeter using the energy transfer within the protein complex to a covalently bound infrared fluorophore and in the total internal reflection fluorescence (TIRF). After about 80 seconds exposure to the excitation laser a fading of the complexes could be observed as well. An exposure to the excitation laser obviously disturbed the reconstitution severely in experiments observing the LHCII formation. Very high background fluorescence caused by the pigment solution necessary for reconstitution overlayed the complex fluorescence, despite the higher-TIRF excitation of merely surface-bound material, proving to be another difficulty. Within the bounds of this work, the reconstitution of surface-immobilized LHCII proteins could be shown in before-after shots, whereas the immediate folding process could not be monitored.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-1022
URN: urn:nbn:de:hebis:77-24763
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: 139 S.
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