Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-1005
Authors: Becke, Sabine
Title: Optimierung einer partikulären Cytomegalovirus-Vakzine
Online publication date: 24-Nov-2010
Language: german
Abstract: Pränatale Infektionen mit dem humanen Cytomegalovirus (HCMV) sind die häufigste Ursache frühkindlicher Schädigung, noch vor dem Down-Syndrom oder dem fetalen Alkoholsyndrom. Reaktivierung dieses Herpesvirus ist darüber hinaus als lebensbedrohliche Komplikation in der Transplantationsmedizin gefürchtet. Von Experten wurde daher die Entwicklung einer Vakzine vielfach angemahnt. Trotz unterschiedlicher Ansätze zu ihrer Entwicklung ist bisher jedoch kein Impfstoff verfügbar. Die Verwendung von subviralen Dense Bodies (DB) des Virus als Vakzinegrundlage stellt eine vielversprechende Strategie zur HCMV-Impfstoffentwicklung dar. DB enthalten bereits in ihrer natürlichen Form wichtige Zielantigene der humoralen und zellulären Immunantwort gegen HCMV. Durch gezielte Mutation des 230.000 Basenpaare umfassenden Genoms des HCMV konnte in Vorarbeiten der Beweis erbracht werden, dass DB hinsichtlich ihres antigenen Repertoires optimierbar sind. Allerdings waren Immunogenität und erzielte Ausbeuten noch unbefriedigend. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Ansatz der Verwendung modifizierter DB als Impfstoff-Grundlage weiter zu entwickeln und Erkenntnisse über die für die Partikelbildung entscheidenden molekularen Mechanismen zu erarbeiten. In einem ersten Abschnitt wurde der Ansatz der Modifikation von DB durch Insertion heterologer Peptidantigene in das virale Tegumentprotein pp65 verfeinert. Das pp65 ist die mengenmäßig dominante Komponente von DB. Durch Herstellung und Austestung definierter HCMV Mutanten konnte die Position 175 des pp65 als geeignete Insertionsstelle für virale wie für nicht-virale Antigene identifiziert werden. In einem zweiten Schritt der Arbeit wurde die Rolle des pp65 im Verlauf der viralen Vermehrung und Morphogenese näher untersucht. Grundlage für diese Analysen war eine Virusmutante, die eine dominant-negative Variante des pp65 exprimierte. Vergleichende massenspektrometrische Untersuchungen unter Einbeziehung von pp65-kompetenten und pp65-negativen Virusmutanten zeigten, dass pp65 in der spät-infizierten Zelle mit dem viralen RNA-Exportfaktor pUL69 und der virale Kinase pUL97 komplexiert vorkommt. Das pp65 wurde als Substrat von pUL97 identifiziert. Daneben wurden essentielle Proteine des viralen Replikationsapparates, sowie zelluläre Proteine des RNA-Metabolismus und Transports und virale DNA in diesen Komplexen gefunden. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass pp65 zu späten Zeitpunkten der viralen Infektion zu Stellen viraler DNA rekrutiert wird und dort regulatorisch in posttranskriptionelle Vorgänge von RNA Prozessierung oder RNA Transport eingreift. Die Hypothese, dass pp65 einen regulatorischen Einfluss auf die RNA-Exportfunktion von pUL69 nimmt, liegt nahe und ist nun in weiteren Analysen prüfbar.
Prenatal infection with the human cytomegalovirus (HCMV) is a major cause of birth defects including neurological disorders in newborns. In addition, reactivation of HCMV leads to live-threatening complication after solid organ or stem cell transplantation. Development of an HCMV vaccine has thus been denoted as a first priority goal. Despite different approaches, no HCMV vaccine has yet been licensed. One promising approach for the development of such a vaccine is the use of subviral particles of HCMV, termed Dense Bodies (DB). DB contain major target antigens of the humoral and cellular immune responses against HCMV. The proof-of-principle could recently be provided that DB can be optimized in their antigenic composition by targeted mutagenesis of the 230.000 bp genome. However, immunogenicity and yield of these recombinant DB were insufficient for further development. The aim of this thesis was consequently to refine the DB approach and to get more insight into the molecular processes that leads to the morphogenesis of these HCMV particles. In a first set of experiments the approach of modifying DB by insertion of a heterologes peptide into the viral tegument protein pp65 was optimized. This tegument protein is the major component of DB. Several mutants were generated and characterized. The position 175 of pp65 was identified as an insertion site for viral and non-viral antigens. In a second step the function of pp65 during viral replication and morphogenesis was analyzed, using different HCMV mutants. Comparative studies by mass spectrometry of pp65-competent and pp65-negative viral strains showed that pp65 was part of a complex in late infected cells containing the viral RNA export factor pUL69 and the viral kinase pUL97. Pp65 could be identified as a substrate of pUL97. Beside this, essential proteins of viral replication compartment as well as cellular proteins of RNA-metabolism and –transport could be detected in these complexes. These results indicate that pp65 is recruited to viral DNA in late stage infected cells and may regulate posttranscriptional processes of RNA processing or RNA transport. One possible scenario could be that pp65 regulates RNA export function of pUL69.
DDC: 610 Medizin
610 Medical sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 04 Medizin
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-1005
URN: urn:nbn:de:hebis:77-24553
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: 154 S.
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