Characterizing the role of RNA-binding proteins in ubiquitin signaling

Abstract

Um ein funktionelles Protein herzustellen, wird DNA in Boten-RNA (mRNA) transkribiert. Diese wird dann posttranskriptionell verarbeitet und schließlich in ein Protein translatiert. Während der Genexpression wird die mRNA von RNA-bindenden Proteinen (RBPs), die das Schicksal der mRNA bestimmen, gebunden und verarbeitet. Eine besondere Klasse von RBPs sind RNA-bindende Ubiquitin-Ligasen (RBULs), welche Substratproteine ubiquitylieren können. Die zelluläre und molekulare Funktion der meisten RBULs ist kaum untersucht. Durch die Implementierung des adaptierten Affinitäts-Aufreinigung (AP)-Ansatzes werden in dieser Arbeit die Interaktions-Netzwerke von sechs RBULs bestimmt. Mit Hilfe der Genfunktions-Ähnlichkeits-Analyse werden die stabilen Bindungspartner von jedem der Köderproteine definiert. Die interagierenden Proteine geben Hinweise auf physiologische Funktionen dieser RBULs. Die identifizierten Interaktionspartner verbinden die Ubiquitylierungs-Maschinerie mit den verschiedenen Schritten des RNA-Metabolismus‘. RBULs verbinden also die molekularen Signalwege der post-transkriptionellen Regulation mit dem Ubiquitin-System. Das Ubiquitin-System ist am Abbau von defekten Proteinen beteiligt, um die Protein-Homöostase sicherzustellen. Schadhafte mRNAs, werden co-translationell erkannt. Im Rahmen dieser Arbeit habe ich herausgefunden, dass eine RBUL, das Makorin-Ringfinger-Protein 1 (MKRN1), an der Blockierung der Ribosomen an Poly(A)-Segementen während der Ribosom-assoziierten Qualitäts-Kontrolle (RQC) beteiligt ist. RQC ermöglicht den Abbau anomaler mRNAs und derer neu translatierten Polypeptide. Dies vermeidet die Ansammlung toxischer Proteine in der Zelle. MKRN1 wird, wahrscheinlich mit der Hilfe seines Interaktionspartners PABPC1/4, vor (vorzeitigen) Poly(A)-Schwänzen und direkt vor A-Segmenten innerhalb von 3' UTRs platziert. So kann MKRN1 defekte mRNAs erkennen. Ribosomen werden durch eine Blockade an der Translation dieser Poly(A)-Schwänze gehindert. MKRN1 ubiquityliert RPS10, was darauf hindeutet, dass MKRN1 Ribosomen durch Ubiquitylierung dieses ribosomalen Proteins stoppt. Auf eine globalere Funktion von MKRN1 in der Regulation der post-transkriptionellen Genexpression weist seine Zugehörigkeit zu einem ‚Boten‘-Ribonukleoprotein-Partikel hin, welches aus mehreren RBPs wie PABPC1, LARP1 und IGF2BP1 besteht.

In order to produce a functional protein, DNA is transcribed into mRNA, which is subsequently post-transcriptionally processed and finally translated into a protein. During gene expression, mRNA is bound and processed by RNA-binding proteins (RBPs), which determine the fate of the mRNA. A special class of RNA-binding proteins are RNA-binding ubiquitin ligases (RBULs), which are capable of ubiquitylating substrate proteins. The cellular and molecular function of most RBULs is hardly understood. By implementing the adapted affinity purification (AP) approach, the interaction networks of six RBULs is determined here. With the help of gene function similarity, a set of stable binding partners for each bait protein is defined. The interacting proteins provide hints towards physiological functions of those RBULs. The identified preys link the ubiquitylation machinery to different steps of RNA metabolism. Hence, RBULs are able to bridge molecular pathways of posttranscriptional regulation and the ubiquitin system. The ubiquitylation system is involved in the degradation of aberrant proteins to ensure protein homeostasis. Aberrant mRNAs can be detected in a co-translational manner. Within this project, I found that one RBUL, namely Makorin Ring Finger Protein 1 (MKRN1), is involved in ribosome stalling at poly(A) stretches during ribosome-associated quality control (RQC). This process enables the degradation of aberrant mRNAs and nascent polypeptides and avoids the accumulation of toxic proteins in the cell. In more detail, MKRN1 is situated in front of (premature) poly(A) tails and upstream of A-segments within 3' UTRs, probably with the help of its interaction partner PABPC1/4. In this way, MKRN1 is capable of recognizing aberrant mRNAs and, by stalling ribosomes, of hindering these from translating into poly(A) tails. MKRN1 ubiquitylates RPS10, which suggests that MKRN1 stalls ribosomes by ubiquitylating a ribosomal protein. Moreover, the finding that MKRN1 is a member of a messenger ribonucleoprotein particle (mRNP), which consists of several RBPs, such as PABPC1, LARP1, and IGF2BP1, hints towards a more global function of MKRN1 in the regulation of post-transcriptional gene expression.