Structured antibody surfaces for bio-recognition and a label-free detection of bacteria

Abstract

Antibody microarrays are of great research interest because of their potential application as biosensors for high-throughput protein and pathogen screening technologies. In this active area, there is still a need for novel structures and assemblies providing insight in binding interactions such as spherical and annulus-shaped protein structures, e.g. for the utilization of curved surfaces for the enhanced protein-protein interactions and detection of antigens. Therefore, the goal of the presented work was to establish a new technique for the label-free detection of bio-molecules and bacteria on topographically structured surfaces, suitable for antibody binding.rnIn the first part of the presented thesis, the fabrication of monolayers of inverse opals with 10 μm diameter and the immobilization of antibodies on their interior surface is described. For this purpose, several established methods for the linking of antibodies to glass, including Schiff bases, EDC/S-NHS chemistry and the biotin-streptavidin affinity system, were tested. The employed methods included immunofluorescence and image analysis by phase contrast microscopy. It could be shown that these methods were not successful in terms of antibody immobilization and adjacent bacteria binding. Hence, a method based on the application of an active-ester-silane was introduced. It showed promising results but also the need for further analysis. Especially the search for alternative antibodies addressing other antigens on the exterior of bacteria will be sought-after in the future.rnAs a consequence of the ability to control antibody-functionalized surfaces, a new technique employing colloidal templating to yield large scale (~cm2) 2D arrays of antibodies against E. coli K12, eGFP and human integrin αvβ3 on a versatile useful glass surface is presented. The antibodies were swept to reside around the templating microspheres during solution drying, and physisorbed on the glass. After removing the microspheres, the formation of annuli-shaped antibody structures was observed. The preserved antibody structure and functionality is shown by binding the specific antigens and secondary antibodies. The improved detection of specific bacteria from a crude solution compared to conventional “flat” antibody surfaces and the setting up of an integrin-binding platform for targeted recognition and surface interactions of eukaryotic cells is demonstrated. The structures were investigated by atomic force, confocal and fluorescence microscopy. Operational parameters like drying time, temperature, humidity and surfactants were optimized to obtain a stable antibody structure.

Mikroarrays aus Antikörpern sind aufgrund ihrer potentiellen Anwendung als Biosensoren für Hochdurchsatzprotein und -pathogenausleseverfahren von großer wissenschaftlicher Bedeutung. Andererseits besteht in diesem aktiven Feld nach wie vor ein Mangel an Techniken, die zu kugel- und kreisringförmigen Proteinstrukturen führen, z.B. zur Verwendung von gekrümmten Strukturen zur verbesserten Protein-Protein Wechselwirkung und der Detektion von Antigenen.rnAus diesem Grund war das Ziel der vorgelegten Arbeit die Etablierung neuer Techniken zur Filterung, Anreicherung und markierungsfreien Detektion von Biomolekülen und Bakterien auf topographisch strukturierten Antikörper-Oberflächen.rnIm ersten Teil der vorgelegte Arbeit werden verschiedene Experimente zur Funktionalisierung einer Glasoberfläche mit Antikörpern beschrieben. Es wurde dabei versucht, diese sowohl kovalent als auch mit Hilfe des Avidin-Biotin-Bindungssystems anzubinden. Am Ende gelang die Anbindung über ein Aktivester-Silan, welches eine Anbindung an Amingruppen (und somit Lysin-Reste) der Antikörper ermöglichte. Im zweiten Teil dieses ersten Teilprojektes wurden inverse Opal mit 10 µm Durchmesser aus Glas erzeugt und ihre Innenseite mit dem beschriebenen Silan beschichtet. Im Anschluss daran wurden Bakterien des Typs Escherichia coli (E. coli) innerhalb der Strukturen und mit Hilfe der Antikörper angebunden. Die Auswertung der Strukturen geschah dabei durch Fluoreszenz-, Phasenkontrast und Elektronenmikroskopie.rnIm zweiten Teilprojekt der vorgelegten Arbeit wird die Erzeugung von mehreren 100 µm2 großen hexagonalen Rastern bestehend aus einigen Mikrometer großen Kreisringstrukturen aus Antikörpern beschrieben. Diese wurden wie die bereits zuvor beschriebenen Opalstrukturen mit Hilfe von monodispersen Polystyrol Kolloiden erzeugt. Es konnte die Funktionstüchtigkeit der strukturieren Antikörperoberflächen gezeigt werden. Hierfür wurden sowohl Proteine (eGFP), Bakterien (E. coli) als auch mit humanem Integrin funktionalisierte DOPC-Vesikel spezifisch an Oberflächen bestehend aus den entsprechenden Antikörpern gebunden. Die Spezifität der Oberflächen konnte durch Blindversuche mit zwei Stämmen nicht-spezifischer Bakterien gezeigt werden. Die Auswertung der Daten geschah erneut durch Fluoreszenz-, Phasenkontrast und Atomkraftmikroskopie.rnDas dritte Teilprojekt beschäftigte sich mit der Erzeugung von sehr flachen (wenige Mikrometer) Filtern für die Sterilfiltration. Diese wurden erneut aus inversen Opalen, jedoch lediglich in der Größe von 1 µm, hergestellt. Die Verbindungsöffnungen zwischen benachbarten Hohlräumen zeigten hierbei den benötigten Durchmesser von lediglich 200 nm. Die inversen Opalstrukturen wurden auf eine neuartige Siliziumcarbidoberfläche aufgebracht. Ebenfalls wurden die generellen Filtrationseigenschaften durch die Aufbringung von E. coli verdeutlicht. Die Auswertung geschah durch Elektronenmikroskopie.rnDie vorgestellten Techniken der topographischen Strukturierung von Glasoberflächen mit Antikörpern stellen vielseitige Methoden für die Detektion unterschiedlicher Biomoleküle dar. Die so erzeugten Oberflächen erlauben eine gegenüber flachen Oberflächen verbesserte Erkennung durch ein erhöhtes Signal-zu-Rausch-Verhältnis und eine verbesserte Anbindung der Bakterien und Moleküle durch gekrümmte Oberflächen. Des Weiteren konnte eine neuartige Methode für zukünftige Integrin-Bindungs-Untersuchungen entwickelt werden.rnDurch die Kombination aus Antikörper-Spezifität und -Sensitivität und einer gekrümmte Oberflächenstruktur besitzt die vorgestellte Technik das Potenzial, die Bio-Detektion einen Schritt weiterzuentwickeln und etablierte Techniken zu unterstützen