Proteomic analysis of ocular surface components by use of HPLC based mass spectrometric strategies

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde eine Top Down (TD) und zwei Bottom Up (BU) MALDI/ESI Massenspektrometrie/HPLC-Methoden entwickelt mit dem Ziel Augenoberfächenkomponenten, d.h. Tränenfilm und Konjunktivalzellen zu analysieren. Dabei wurde ein detaillierter Einblick in die Entwicklungsschritte gegeben und die Ansätze auf Eignung und methodische Grenzen untersucht. Während der TD Ansatz vorwiegend Eignung zur Analyse von rohen, weitgehend unbearbeiteten Zellproben fand, konnten mittels des BU Ansatzes bearbeitete konjunktivale Zellen, aber auch Tränenfilm mit hoher Sensitivität und Genauigkeit proteomisch analysiert werden. Dabei konnten mittels LC MALDI BU-Methode mehr als 200 Tränenproteine und mittels der LC ESI Methode mehr als 1000 Tränen- sowie konjunktivale Zellproteine gelistet werden. Dabei unterschieden sich ESI- and MALDI- Methoden deutlich bezüglich der Quantität und Qualität der Ergebnisse, weshalb differente proteomische Anwendungsgebiete der beiden Methoden vorgeschlagen wurden. Weiterhin konnten mittels der entwickelten LC MALDI/ESI BU Plattform, basierend auf den Vorteilen gegenüber dem TD Ansatz, therapeutische Einflüsse auf die Augenoberfläche mit Fokus auf die topische Anwendung von Taurin sowie Taflotan® sine, untersucht werden. Für Taurin konnten entzündungshemmende Effekte, belegt durch dynamische Veränderungen des Tränenfilms, dokumentiert werden. Außerdem konnten vorteilhafte, konzentrationsabhängige Wirkweisen auch in Studien an konjunktival Zellen gezeigt werden. Für die Anwendung von konservierungsmittelfreien Taflotan® sine, konnte mittels LC ESI BU Analyse eine Regenerierung der Augenoberfläche in Patienten mit Primärem Offenwinkel Glaukom (POWG), welche unter einem “Trockenem Auge“ litten nach einem therapeutischen Wechsel von Xalatan® basierend auf dynamischen Tränenproteomveränderungen gezeigt werden. Die Ergebnisse konnten mittels Microarray (MA) Analysen bestätigt werden. Sowohl in den Taurin Studien, als auch in der Taflotan® sine Studie, konnten charakteristische Proteine der Augenoberfläche dokumentiert werden, welche eine objektive Bewertung des Gesundheitszustandes der Augenoberfläche ermöglichen. Eine Kombination von Taflotan® sine und Taurin wurde als mögliche Strategie zur Therapie des Trockenen Auges bei POWG Patienten vorgeschlagen und diskutiert.

In the present work a top down (TD) MALDI and two bottom up (BU) MALDI/ESI mass spectrometric (MS) based methods have been developed integrating HPLC to study the ocular surface encircling tear film and conjunctival cells. A detailed overview of development steps, benefits and limitations was given in the work. Whereas the TD approach was found to be applicable to examine crude cellular specimen, BU approaches allowed the sensitive and accurate analysis of processed conjunctival cell and also tear film proteins. By use of the LC MALDI BU method more than 200 tear proteins could be detected, LC ESI resulted in more than 1000 tear and conjunctival cell proteins. Regarding quality and quantity ESI and MALDI methods showed distinct differences discussed to be useful depending on the proteomic question. Moreover, by use of the developed LC MALDI/ESI BU platform, which clearly performed advantageous over the TD approach, the influence of taurine and Taflotan® sine application on the ocular surface could be studied. Taurine could be demonstrated to lead to anti-inflammatory effects on the ocular surface reflected by dynamic changes in tear film proteins, predominantly documented in contact lens induced dry eye. Beneficial effects could also be supported in conjunctival cell studies, however, showing a dose-dependent taurine effect. Regarding the topical application of preservative-free Taflotan® sine, by use of LC ESI BU analysis, ocular surface recovery could be confirmed in primary open angle glaucoma (POAG) patients suffering from dry eye reflected by dynamic tear film changes after a therapeutic switch from preservative containing Xalatan®. This could also be validated by microarray (MA) experiments. In taurin studies as well in the Taflotan® sine study, characteristic ocular surface protein candidates could be revealed, which can be used to objectively assess the ocular surface health status. A use of taurine for dry eye therapy and a combinatory strategy of Taflotan® sine and taurine have been proposed for future therapeutic strategies in terms of medication induced dry eye in glaucoma.